受容体活性化型チャネルの機能解明を目指したTRPチャネル拮抗剤の開発

开发 TRP 通道拮抗剂，旨在阐明受体激活通道的功能

• 批准号: 18750146
• 负责人: 清中 茂樹
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18750146/
• 关键词: TRPチャネル; 拮抗剤; アフィニティーラベル

昨年度に選択的なTRPチャネル拮抗剤が得られたので、アフィニティーラベル化を応用した新しいタンパク質修飾法を用いて拮抗剤の作用部位及び作用機構について検討した。具体的には以下の手順で行った。1)アフィニティーラベル化反応部位及びラベル化修飾が可能な官能基を有するピラゾール誘導体(ラベル化剤)の分子設計および合成 2)培養細胞内にこのラベル化剤を加えて光照射することによるチャネルのアフィニティーラベル化 3)ラベル化剤の修飾部位に標識剤(ビオチン)を選択的に修飾した。その際に用いる反応は、ケトンーヒドロキシアミンという、生体内には存在しない化学反応を用いているので、副反応を起こすことなくラベル化タンパク質だけをビオチン標識できた。4)TRPチャネルの抗体及びビオチンに対する抗体を利用したアフィニティー精製を行うことで、ラベル化されたTRPチャネルを得た。光アフィニティーラベル化の進行については、ウェスタンブロッティング法を用いて確認を行った。また、透過型電子顕微鏡を用いてチャネルに拮抗剤が直接結合していることも明らかにした。具体的にはラベル化後修飾ステップでビオチン標識を行い、アビジンを使ったアフィニティ精製後に標識タンパクの電子顕微鏡観察(ネガティブ染色)を行うという方法である。その結果を基に、チャネルの阻害機構及び活性化機構まで考察した。

自从我们去年获得了选择性TRP通道拮抗剂以来，我们使用一种应用亲和标记的新蛋白质修饰方法研究了拮抗剂的作用位点和机制。具体而言，进行了以下的步骤。 1) 具有亲和标记反应位点和能够进行标记修饰的官能团的吡唑衍生物(标记剂)的分子设计和合成2) 通过将该标记剂添加到培养细胞中并用光照射来形成通道3。 ）用标记剂（生物素）选择性地修饰标记剂的修饰位点。此时使用的反应使用一种称为酮-羟胺的化学反应，这种反应在生物体中不存在，因此只有标记的蛋白质才能用生物素标记，而不会引起副反应。 4)使用TRP通道抗体和生物素抗体进行亲和纯化，得到标记的TRP通道。使用蛋白质印迹证实了光亲和标记的进展。此外，使用透射电子显微镜，我们发现拮抗剂直接与通道结合。具体而言，是在标记后的修饰工序中进行生物素标记，使用抗生物素蛋白进行亲和纯化后，用电子显微镜观察标记的蛋白质(阴性染色)的方法。根据结果​​，我们考虑了通道抑制和激活机制。

项目成果

The TRPC3 channel has a large internal chamber surrounded by signal sensing antennas

• DOI: 10.1016/j.jmb.2006.12.043
• 发表时间: 2007-03-23
• 期刊: JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.6
• 作者: Mio, Kazuhiro;Ogura, Toshihiko;Sato, Chikara
• 通讯作者: Sato, Chikara

Oligo-Asp Tag/Zn(II) complex probe as a new pair for labeling and fluorescence imaging of proteins

• DOI: 10.1021/ja0618604
• 发表时间: 2006-08-16
• 期刊: JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
• 影响因子: 15
• 作者: Ojida, Akio;Honda, Kei;Hamachi, Itaru
• 通讯作者: Hamachi, Itaru

RIMl confers sustained activity and neurotransmitter vesicle anchoring to presynaptic Ca2+ channels.

RIM1赋予持续的活性和锚定于突触前Ca 2 通道的神经递质囊泡。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Nature Neurosci. 10
• 作者: Kiyonaka S;wakamori M;Miki T;Uriu Y;Nonaka M;Bito H;Beedle AM;Mori E;Hara Y;De Waard M;Kanagawa M;Itakura M;Takahashi M;Campbeil KP & Mori Y
• 通讯作者: Campbeil KP & Mori Y

Mutation associated with an autosomal dominant cone-rod dystrophy CORD7 modifies RIMl-mediated modulation of voltage-dependent Ca2+ channels.

与常染色体显性锥杆营养不良相关的突变CORD7修饰RIM1介导的电压依赖性Ca 2 通道的调节。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Channels 1
• 作者: Miki T;Kiyonaka S;Uriu Y;De Waard M;Wakamori M;Beedle AM;Campbell KP;Mori Y
• 通讯作者: Mori Y