マウスD-アスパラギン酸オキシダーゼの遺伝子クローニングとその変異体解析

小鼠D-天冬氨酸氧化酶基因克隆及其突变体分析

基本信息

批准号：
18790062
负责人：
片根真澄
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

D-アスパラギン酸(D-Asp)、N-メチルーD-AspおよびD-グルタミン酸といった酸性D-アミノ酸を立体特異的に分解する生体内酸化酵素として、D-アスパラギン酸オキシダーゼ(DDO)が知られている。ホモロジーモデリング法により構築したマウスDDOの推測三次元構造より活性部位に位置することが予測されたSer-308残基に着目し、この残基の側鎖の水酸基が持つ役割を解明することを目的として、site-directed mutagenesisによるマウスDDOの変異体解析を行った。Ser-308残基がGly、AlaあるいはTyrに置換されたマウスDDOをGST、HisおよびSタグがN末に付加された融合蛋白質として大腸菌で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。各変異体の酵素学的機能を調べた結果、側鎖に水酸基を持たないGly-308およびAla-308変異体のD-AspおよびN-メチル-D-Aspに対する触媒効率は野生型酵素と比較して有意に上昇しており、また、補酵素FADに対する親和性も上昇していた。一方、野生型酵素と同様に側鎖に水酸基を持つTyr-308変異体は、D-AspおよびN-メチル-D-Aspに対する触媒効率、および補酵素FADに対する親和性が有意に低下していた。Gly-308変異体に関しては、HisタグのみがN末に付加された融合蛋白質を用いた解析も行い、同様の結果が得られることを確認した。本研究結果より、Ser-308残基がマウスDDOの機能発現に関与する重要なアミノ酸残基であることが明らかになった。また、この残基の側鎖の水酸基は、反応速度、基質との結合、およびFADとの結合に対して抑制的に機能していることが示唆された。

D-天冬氨酸氧化酶（DDO）被称为体内氧化酶，立体特异性地降解了酸性D-氨基酸，例如D-天冬氨酸（D-ASP），N-甲基D-ASP和D-谷氨酸。专注于SER-308残基，该残基预计是由同源性建模构建的小鼠DDO的推断的三维结构位于活性位点时，我们使用位置定向的诱变对小鼠DDO进行了突变分析，目的是阐明该残留物侧链的羟基的作用。用Gly，Ala或Tyr取代的SER-308残基的小鼠DDO在大肠杆菌中以GST的融合蛋白表示，他的S-TAG和S-TAG添加到N末端，并通过亲和色谱纯化。研究了每个突变体的酶促功能，与野生型酶相比，侧链没有羟基的Gly-308和Ala-308突变体的催化效率显着增加，并且对辅酶的亲和力也增加了。另一方面，侧链上有羟基的Tyr-308突变体，例如野生型酶，显着降低了D-ASP和N-甲基-D-ASP的催化效率，以及对鞘酶FAD的亲和力。关于GLY-308突变体，使用融合蛋白仅将其标签添加到N末端进行分析，并确认可以获得相似的结果。这项研究的结果表明，Ser-308残基是与小鼠DDO的功能表达有关的重要氨基酸残基。还建议该残基的侧链上的羟基对反应速率，与底物结合并与FAD结合起到抑制作用。