心疾患に関連する新奇生理活性物質 D-グルタミン酸の分解酵素に関する研究

与心脏病相关的新型生理活性物质D-谷氨酸降解酶的研究

基本信息

批准号：
21K06085
负责人：
片根真澄
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、遊離の D-グルタミン酸（D-Glu）の分解酵素として最近同定した、哺乳類 D-Glu シクラーゼ（DGLUCY；D-Glu を 5-オキソ-D-プロリン［5-オキソ-D-Pro］と水に分解する反応を可逆的に触媒する酵素）の代謝機構の全貌を解明することである。この目的に向けて、DGLUCY 活性の迅速で簡便な測定法の開発のほか、DGLUCY の構造機能相関の解明を試みる。2021 年度には、吸光度計を用いた比色定量に基づく迅速で簡便な DGLUCY 活性の新規測定法について解析した。その結果、5-オキソ-D-Pro の 2-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩による誘導体化反応の最適な条件を決定した。また、比色定量法による 5-オキソ-D-Pro の感度を解析した。その結果、96-well プレートを用いた比色定量法が、我々が以前に開発した高速液体クロマトグラフィーを用いた測定法（HPLC-UV 法）よりも低感度である一方で、384-well プレートを用いた比色定量法は HPLC-UV 法よりも高感度であることが明らかになった。2022 年度は、比色定量法が、DGLUCY の酵素活性の測定に適用可能かどうかを解析した。すなわち、比色定量法を用いてマウス組換え DGLUCY の D-Glu に対する動力学定数を決定し、HPLC-UV 法を用いて決定した値と比較した。その結果、比色定量法を用いて DGLUCY の酵素活性を正確に測定できることが明らかになった。また、野生型および DGLUCY ノックアウトマウスそれぞれから樹立した培養細胞株の抽出液を酵素源として DGLUCY 活性を測定することにより、本法の正確性とともに頑健性を解析した。その結果、比色定量法を用いて細胞可溶化液中における DGLUCY の酵素活性を正確に測定できることが明らかになった。

The purpose of this study is to elucidate the full metabolic mechanism of mammalian D-Glu cyclase (DGLUCY; an enzyme that reversibly catalyzes the reaction that degrades D-Glu to 5-oxo-D-proline [5-oxo-D-Pro] with water), which has recently been identified as a degradation enzyme for free D-glutamic acid (D-Glu).为此，我们将开发一种快速便捷的方法来测量DGLucy活性，并阐明DGlucy的结构和功能相关性。在2021财年中，我们分析了一种新的方法，用于测量DGLucy活性，该方法基于使用吸光度表的比色测定而快速且方便。结果，确定了5-氧-D-Pro与2-硝基苯基氢氮嗪盐酸盐的最佳条件。此外，通过比色法分析了5-氧-D-Pro的灵敏度。结果表明，使用96孔板的比色测定不如我们先前开发的高性能液相色谱法（HPLC-UV方法）的测量敏感，而使用384孔板的比色测定比HPLC-UV方法更敏感。在2022财年中，我们分析了是否可以将比色定量方法应用于DGlucy酶活性的测量。也就是说，使用比色法测定了D-GLU小鼠重组DGLucy的动力学常数，并将其与使用HPLC-UV方法确定的值进行了比较。结果，可以使用比色法准确测量dglucy的酶活性。此外，通过使用从野生型和dglucy敲除小鼠作为酶来源的培养细胞系的提取物测量DGLucy活性来分析该方法的准确性和鲁棒性。结果，可以使用比色测定法准确测量细胞裂解液中dglucy的酶活性。