立体構造情報を基盤とするカンナビノイド生合成酵素の触媒活性コントロールとその応用

基于3D结构信息的大麻素生物合成酶催化活性控制及其应用

基本信息

批准号：
18780089
负责人：
田浦太志
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780089/
关键词：
生合成酵素カンナビノイド立体構造

项目摘要

昨年度、X線結晶解析に基づきカンナビノイド生合成酵素THCA synthaseの立体構造を解明した。一方、CBDA synthaseに関しては昆虫細胞発現システムを精査し、精製とキャラクダリゼーションについて報告したが(FEBS Letters 2007)、十分量の酵素が得られなかったため、THCA synthaseの立体構造を基にした分子モデリングで推定構造を作製した。両酵素の活性部位には5ケ所6残基の相違が確認され、これらのアミノ酸残基が両酵素め触媒する酸化閉環反応及び生成物の作り分けに重要な役割を果だすことが示唆された。そこで、各アミノ酸残基について部位特異的変異導入法による相互変換を行い、得られた変異酵素の触媒活性を検討した。この結果、各変異酵素の活性に劇的な変化は見られず、少なぐともニケ所以上のアミノ酸が協調して触媒活性を決定していると考えられた。そとで、各種組み合わせでの変異導入をさらに行っている。また、生合成酵素のカンナビノイド生産への応用を実現するためめ予備的実験とレて、分泌生産した組み換えTHCA synthaseを基質CBGAとインキュベートすることにより簡便かつ立体選択的なTHCA生産システムを確立した(Biochern. Biophys. Res. Cemmun. 2007)。以上のように本研究では従来、解明されていなかったカンナビノイド合成酵素の構造を原子レベルではじめて解明し、触媒活性の制卸およびカンナビノイド生産への応用に向けた基盤を確立した。

去年，我们基于X射线晶体学阐明了大麻素生物合成酶THCA合酶的三维结构。另一方面，关于 CBDA 合酶，我们研究了昆虫细胞表达系统并报告了其纯化和表征（FEBS Letters 2007），但由于我们无法获得足够量的酶，因此我们基于这三种酶进行了分子建模THCA 合酶的三维结构估计的结构是使用创建的。在两种酶的活性位点中鉴定出五个位置的六个残基的差异，表明这些氨基酸残基在两种酶催化的氧化闭环反应和产物的分化中发挥重要作用。因此，我们通过定点诱变对每个氨基酸残基进行互变，并检查所得突变酶的催化活性。结果，没有观察到每种突变酶的活性发生显着变化，这表明至少两个位置的氨基酸协同决定催化活性。我们还引入了各种组合的突变。此外，为了实现生物合成酶在大麻素生产中的应用，作为初步实验，我们通过将分泌并产生的重组THCA合酶与底物CBGA（Biochern.Biophys.Res.Cemmun）一起孵育，建立了一个简单且立体选择性的THCA生产体系。 2007）。如上所述，本研究首次在原子水平上阐明了迄今为止尚未阐明的大麻素合酶的结构，为控制催化活性并将其应用于大麻素生产奠定了基础。