立体構造情報を基盤とするカンナビノイド生合成酵素の触媒活性コントロールとその応用

基于3D结构信息的大麻素生物合成酶催化活性控制及其应用

基本信息

批准号：
18780089
负责人：
田浦太志
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780089/
关键词：
生合成酵素カンナビノイド立体構造

项目摘要

昨年度、X線結晶解析に基づきカンナビノイド生合成酵素THCA synthaseの立体構造を解明した。一方、CBDA synthaseに関しては昆虫細胞発現システムを精査し、精製とキャラクダリゼーションについて報告したが(FEBS Letters 2007)、十分量の酵素が得られなかったため、THCA synthaseの立体構造を基にした分子モデリングで推定構造を作製した。両酵素の活性部位には5ケ所6残基の相違が確認され、これらのアミノ酸残基が両酵素め触媒する酸化閉環反応及び生成物の作り分けに重要な役割を果だすことが示唆された。そこで、各アミノ酸残基について部位特異的変異導入法による相互変換を行い、得られた変異酵素の触媒活性を検討した。この結果、各変異酵素の活性に劇的な変化は見られず、少なぐともニケ所以上のアミノ酸が協調して触媒活性を決定していると考えられた。そとで、各種組み合わせでの変異導入をさらに行っている。また、生合成酵素のカンナビノイド生産への応用を実現するためめ予備的実験とレて、分泌生産した組み換えTHCA synthaseを基質CBGAとインキュベートすることにより簡便かつ立体選択的なTHCA生産システムを確立した(Biochern. Biophys. Res. Cemmun. 2007)。以上のように本研究では従来、解明されていなかったカンナビノイド合成酵素の構造を原子レベルではじめて解明し、触媒活性の制卸およびカンナビノイド生産への応用に向けた基盤を確立した。

去年，我们阐明了基于X射线晶体学的大麻素生物合成酶THCA合酶的三维结构。另一方面，对于CBDA合酶，我们检查了昆虫细胞表达系统并报告的纯化和表征（FEBS LETTELS 2007），但是由于未获得足够量的酶，我们基于Thca合酶的三维结构，使用分子建模创建了推定的结构。两种酶的活性位点证实了5种残基之间的差异，这表明这些氨基酸残基在酶和产物的产生中催化的氧化环闭合反应中起着重要作用。因此，每个氨基酸残基通过位置定向的诱变互转换，并研究了所获得的突变酶的催化活性。结果，在每种突变酶的活性中没有观察到巨大的变化，因此认为至少在其他位点上方至少有几个氨基酸来确定催化活性。另外，诱变是通过各种组合进行的。此外，为了实现生物合成酶在大麻素生产中的应用，通过将分泌的重组THCA合酶与底物CBGA（Biochern。Biophys。Biophys。Res。Cemmun。2007）孵育，建立了一个简单而立体的THCA生产系统。如上所述，这项研究阐明了大麻素合酶的结构，该结构先前尚未在原子水平上阐明，并为催化活性和对大麻素生产的应用建立了基础。