マウス胚性幹細胞の未分化状態維持に関与する特異的細胞周期制御因子の解析

参与维持小鼠胚胎干细胞未分化状态的特定细胞周期调节因子的分析

基本信息

批准号：
18770186
负责人：
藤井裕子
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770186/
关键词：
マウス胚性幹細胞細胞周期 E2F APC C Emil 胚性幹細胞 Emi1 Oct-4

项目摘要

細胞周期制御の観点においてES細胞の自己複製様式は非常に特異であり,これを支持している分子基盤の解明はES細胞の自己増殖機構及びその未分化状態の維持機構を理解する上で大変重要であると期待される。申請者らは未分化ES細胞特異的に大量発現する細胞周期制御因子としてCdc6,ASK,Cychin A,Cyclin Bの4つのキーファクターを既に同定しているが,これらは全てユビキチンリガーゼAPC/Cの基質であった。また,未分化ES細胞ではAPCの活性阻害因子Emi1が大量発現しており,この発現制御がES細胞分化の分化誘導に伴い急速に減少することを見出した。このEmi1の発現制御領域にはE2F転写因子結合部位が複数存在し,その転写活性は細胞の分化状態に依存的してE2Fファミリーによる制御を受けることを明らかにした。当該年度ではこの発現制御機構のさらに詳細な解析を目指してChlP assayを行い,これらE2F結合部位上に,未分化状態では活性促進的,分化誘導時には抑制的なE2F複合体が形成されることを示した。一方でEmi1のsiRNAを行ったところCyclin A,BやGemininがタンパク質レベルで減少するとともに顕著な再複製が引き起こされることを見いだした。さらに生細胞での細胞周期進行のモニタリングを可能とした蛍光タンパク質マーカーFucciを用いた解析により,未分化ES細胞の細胞周期においてもAPC/C依存的な複製制御因子のタンパク質分解が起こること,さらにレチノイン酸処理によりG1期が顕著な分化細胞型の細胞周期が誘導されることを明らかにした。以上の知見は,E2Fファミリーにより制御されるEmi1がES細胞の分化状態に依存した細胞周期制御の一因を担うことを強く示唆するとともに,未分化ES細胞での細胞周期依存的な複製制御因子の分解を初めて示すものである。

就细胞周期调节而言，ES细胞的自我更新模式非常具体，预计支持这一支持的分子基础的阐明对于理解ES细胞的自我增殖机制以及维持其未分化状态的机制非常重要。申请人已经确定了四个关键因素，Cdc6，ask，Cychin A和Cyclin B是在未分化的ES细胞中特异性表达的细胞周期调节剂，所有这些细胞周期细胞都是泛素连接酶APC/c的底物。此外，我们发现EMI1是APC的活性抑制剂，在未分化的ES细胞中大量表达，并且这种调节的调节随着ES细胞的分化而迅速降低。据表明，EMI1的表达控制区域中存在多个E2F转录因子结合位点，并且其转录活性由E2F家族控制，具体取决于细胞的分化状态。在这个财政年度，我们进行了一个CHLP测定法，以进一步详细分析了该表达控制机制，并表明在诱导分化后，在未分化状态和抑制性E2F复合物中形成的E2F复合物。另一方面，当EMI1为siRNA时，细胞周期蛋白A，B和Geminin在蛋白质水平下降低，发现引起了显着的重复复制。此外，使用荧光蛋白标记物FUCCI进行分析，该分析允许监测活细胞中的细胞周期进展，表明复制调节剂的APC/C依赖性蛋白解析甚至在未分化的ES细胞的细胞周期中也会发生，并且靶毒酸治疗诱导了具有突出的G1相分化细胞类型的细胞周期。上面的发现强烈表明，受E2F家族调节的EMI1在细胞周期调节中起着取决于ES细胞分化状态的因素，这是第一次在未分化的ES细胞中第一次将复制调节剂降解降解。