エンドサイトーシスにおけるクラスリン被覆小胞のエンドソームへの輸送機構の解析

网格蛋白包被的囊泡胞吞过程中向内体的转运机制分析

基本信息

批准号：
06J40104
负责人：
十島純子
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度計画に沿って以下の研究を実施した。1つ目の研究課題である「エンドサイトーシスにおけるクラスリン被覆小胞とエンドソームの会合過程のリアルタイム解析」については、アクチンケーブルを介したクラスリン被覆小胞の輸送機構の解析を行なった。アクチンケーブルを介したクラスリン被覆小胞の輸送を制御している蛋白質を同定するために、エンドサイトーシス関連蛋白質、およびエンドソーム関連蛋白質をコードする、約300種類の遺伝子欠損変異体を作成した。これらの変異体を用いて、まずアクチンケーブルの動態に異常の見られる変異体をスクリーニングした結果、CAP1, CAP2, SAC6の遺伝子欠損変異体でいおいて、アクチンケーブルの異常が認められた。これらの中で、SAC6変異体において、クラスリン被覆小胞のエンドソームへの輸送効率が著しく低下していることが分かった。また、アクチンケーブルの重合因子であるForminの酵母ホモログであるBnilpのCAP1, CAP2, SAC6変異体における局在の解析を行い、これらの変異体においてBnilpの局在が変化していることを明らかにした。2つ目の研究課題である、「初期エンドソームのエンドサイトーシス部位への移動の分子メカニズムの解析」については、今回、初期エンドソームを特異的に標識するマーカーの作製を試みた。データーベース検索の結果より20種類程度のエンドソーム局在タンパク質を選び、それらにGFPを付加して発現させ、その共局を調べた。この結果、酵母Rab5ホモログであるYpt51pが一部、初期エンドソームに局在することを明らかにした。また、アクチン重合阻害剤で処理した細胞において、Ypt51-GFPで標識したエンドソームの移動速度が低下することを見出した。

按照今年的计划开展了以下研究。关于第一个研究课题“胞吞过程中网格蛋白包被的囊泡和内体的关联过程的实时分析”，我们分析了网格蛋白包被的囊泡通过肌动蛋白电缆的运输机制。为了鉴定控制网格蛋白包被的囊泡通过肌动蛋白电缆运输的蛋白质，我们创建了大约 300 个编码内吞作用相关和内体相关蛋白质的基因缺失突变体。利用这些突变体，我们首先筛选出肌动蛋白线动力学异常的突变体，结果在缺乏 CAP1、CAP2 和 SAC6 基因的突变体中观察到肌动蛋白线异常。其中，我们发现在SAC6突变体中，网格蛋白包被的囊泡向内体的转运效率显着降低。我们还分析了 Bnilp（一种肌动蛋白电缆聚合因子 Formin 的酵母同源物）在 CAP1、CAP2 和 SAC6 突变体中的定位，并揭示了 Bnilp 的定位在这些突变体中发生了变化。关于第二个研究课题“早期内体运动到内吞位点的分子机制的分析”，我们试图创建一个专门标记早期内体的标记。从数据库检索的结果中，我们选择了大约20种内体定位蛋白，将GFP添加到它们中，表达它们，并研究它们的共定位。结果，我们发现 Ypt51p（酵母 Rab5 同源物）部分定位于早期内体。我们还发现，在用肌动蛋白聚合抑制剂处理的细胞中，用 Ypt51-GFP 标记的内体的运动速度降低。