H/K-ATPaseの構造解析とイオン輸送の分子メカニズムの解析

H/K-ATPase结构分析及离子转运分子机制分析

基本信息

批准号：
06J03248
负责人：
西澤知宏
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J03248/
关键词：
P型ATPase H+,K+-ATPase 三次元構造二次元結晶極低温電子顕微鏡 P-type ATPase H K-ATPase

项目摘要

豚の胃より採取したH/K-ATPaseを用いて、これまでに確立した結晶化条件により二次元結晶を作製し、極低温電子顕微鏡による構造解析を行うことで、6.5Åの分解能で立体構造を明らかにすることができた。同じP-typeファミリーに属するCa-ATPaseにおいては、今回の結晶化の際に加えたAlFxとADPの組み合わせはE1P-ADPの構造を模倣する阻害剤として用いられていたが、我々の立体構造はE2Pの反応中間体であることがわかった。今回明らかになったH/K-ATPaseの構造ではbサブユニットのN末端がaサブユニットのPドメイン周辺と相互作用していることが示唆されたため、この相互作用によりE2Pの構造の安定化に寄与していることが予想された。そこで、βサブユニットのN末端を欠損させた変異体を作製し、HEK細胞において野生型のαサブユニットと共発現させることで、E1P-ADPとE2Pの平衡反応にどのような影響を与えているのか機能解析を行った。その結果、βサブユニットのN末端を8アミノ酸以上欠損させた変異体では、E2PからE1P-ADPの逆反応が生じやすくなっていることが明らかになった。これまで、βサブユニットはαサブユニットのフォールディングや膜輸送に関わると考えられていたが、今回の研究により酵素機能を担うαサブユニットとの相互作用により実際の酵素反応にも影響を与えるという新しい機能が明らかになった。また、今回見られた相互作用はNa/K-ATPaseの構造では見られておらず、H/K-ATPaseに特異的な機構であると考えられる。H/K-ATPaseの発現している胃壁細胞によって形成されるプロトン濃度勾配は100万倍という驚異的な値であり、これは他のトランスポーターと比較しても大きいことから、この研究によって明らかになったβサブユニットによる逆反応を防ぐ仕組みがこのような特殊な性質に寄与していることが考えられる。

使用从猪胃中收集的H/K-ATPase，在先前建立的结晶条件下制备了二维晶体，并通过使用低温电子显微镜进行结构分析，以6.5Å的分辨率揭示了三维结构。在属于同一P型家族的CA-ATPase中，在当前结晶过程中添加的ALFX和ADP的组合用作模仿E1P-ADP的结构的抑制剂，但发现我们的空间结构是E2P的反应中间。这次揭示的H/K-ATPase的结构表明，B亚基的N末端与A亚基的P域相互作用，并且可以预测这种相互作用有助于E2P结构的稳定。因此，我们创建了一个缺乏β亚基的N末端的突变体，并与HEK细胞中的野生型α亚基共表达，以分析功能分析以确定其如何影响E1P-ADP和E2P之间的平衡反应。结果，有发现在具有8个氨基酸或β亚基的N末端的突变体中，E1P-ADP的反反应更可能发生在E2P中。到目前为止，人们认为β亚基与α亚基的折叠和膜转运有关，但是这项研究揭示了一种新功能，该功能通过与α亚基相互作用来影响实际的酶反应，该酶反应负责酶功能。此外，这次看到的相互作用在Na/k-ATPase的结构中没有看到，并且被认为是针对H/K-ATPase的。表达H/K-ATPase的胃壁细胞形成的质子浓度梯度是100万次的惊人值，比其他转运蛋白大，因此人们认为，预防由这项研究揭示的β亚基引起的反向反应的机制有助于这项特殊特性。