新規機能に着目した細胞周期制御因子サイクリンの機能解析

细胞周期调节因子细胞周期蛋白的功能分析，重点关注新功能

基本信息

批准号：
18870013
负责人：
三村覚
金额：
$ 1.74万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18870013/
关键词：
細胞周期 CDK サイクリン蛋白質リン酸化

项目摘要

真核生物の細胞周期はCDK (cyclin dependent kinase)の活性により制御されている。CDKのキナーゼ活性は制御因子であるサイクリンの結合によって活性化される。CDKのリン酸化サイトの共通配列はごく単純なS/TPXK/Rであり、実際にin vitroでは多数の基質蛋白質をリン酸化することが報告されている。しかし、CDKの細胞内での直接の標的分子は不明な部分が多い。私はこれまでに、出芽酵母のサイクリンであるClb2が基質であるCdc6とリン酸化依存的に結合することを見いだした。本研究はこのサイクリンの新規機能に着目して、サイクリンとリン酸化依存的に結合してその活性が調節されているCDK基質を探索することにより細胞周期研究に貢献するものである。まず、出芽酵母ツーハイブリッド系を用いて、出芽酵母Clb2に結合する蛋白質の単離を試みた。野生型CLB2遺伝子をbaitに用いた場合、細胞増殖をほぼ抑制してしまうことがわかったので、CDKと結合できないが、リン酸化依存的結合は可能なKAEAFA変異体をbaitに用いたところ、10数種の候補遺伝子を単離することができた。そのうちのいくつかは、CDKのリン酸化サイトを有しており、実際にin vitroでCDKによってリン酸化されることが報告されているものであった。今後はこれらの候補蛋白質で、Clb2とリン酸化依存的に結合するものがあるかどうか調べていく予定である。高等真核生物でもサイクリンにリン酸化依存的に結合する蛋白質を同定する目的で、レトロウイルス発現系を用いて野生型サイクリンB1、あるいは、リン酸化依存的結合のない変異型サイクリンB1を恒常的に発現する細胞株を得ることに成功した。今後はこれらのサイクリンに結合する蛋白質を生化学的に単離し質量分析を用いた同定を行っていく予定である。

真核生物的细胞周期受CDKS（细胞周期蛋白依赖性激酶）的活性调节。通过调节因子细胞周期蛋白的结合激活CDK的激酶活性。 CDK的磷酸化位点的共识序列是非常简单的S/TPXK/R，据报道，在体外，它实际上磷酸化了大量的底物蛋白。但是，细胞内CDK的直接靶标分子通常尚不清楚。我以前已经发现，来自发芽酵母的细胞周期蛋白以磷酸化依赖性方式与底物CDC6结合。这项研究的重点是该细胞周期蛋白的新功能，并通过搜索以磷酸化依赖性方式与细胞周期蛋白结合并调节其活性来有助于细胞周期研究。首先，我们尝试通过使用萌芽的酵母两杂交系统来隔离与CLB2结合的蛋白质。已经发现，当使用野生型Clb2基因用于诱饵时，它几乎抑制了细胞增殖，并且不可能与CDK结合，但是当在诱饵中使用了能够磷酸化依赖性结合的Kaeafa突变体，可以分离出十个候选基因。其中一些具有CDK的磷酸化位点，据报道在体外CDK磷酸化。将来，我们将研究这些候选蛋白是否依赖于CLB2结合磷酸化。为了鉴定在较高真核生物中依赖于细胞周期蛋白的磷酸化结合的蛋白质，我们成功地获得了一种细胞系，该细胞系组成型表达野生型细胞周期蛋白B1或突变的细胞周期蛋白B1，该细胞系使用逆转录病毒表达系统没有磷酸化依赖性依赖性结合。将来，我们计划将生化分离蛋白与这些细胞周期蛋白结合并使用质谱鉴定它们。