新規機能に着目した細胞周期制御因子サイクリンの機能解析

细胞周期调节因子细胞周期蛋白的功能分析，重点关注新功能

基本信息

批准号：
18870013
负责人：
三村覚
金额：
$ 1.74万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18870013/
关键词：
細胞周期 CDK サイクリン蛋白質リン酸化

项目摘要

真核生物の細胞周期はCDK (cyclin dependent kinase)の活性により制御されている。CDKのキナーゼ活性は制御因子であるサイクリンの結合によって活性化される。CDKのリン酸化サイトの共通配列はごく単純なS/TPXK/Rであり、実際にin vitroでは多数の基質蛋白質をリン酸化することが報告されている。しかし、CDKの細胞内での直接の標的分子は不明な部分が多い。私はこれまでに、出芽酵母のサイクリンであるClb2が基質であるCdc6とリン酸化依存的に結合することを見いだした。本研究はこのサイクリンの新規機能に着目して、サイクリンとリン酸化依存的に結合してその活性が調節されているCDK基質を探索することにより細胞周期研究に貢献するものである。まず、出芽酵母ツーハイブリッド系を用いて、出芽酵母Clb2に結合する蛋白質の単離を試みた。野生型CLB2遺伝子をbaitに用いた場合、細胞増殖をほぼ抑制してしまうことがわかったので、CDKと結合できないが、リン酸化依存的結合は可能なKAEAFA変異体をbaitに用いたところ、10数種の候補遺伝子を単離することができた。そのうちのいくつかは、CDKのリン酸化サイトを有しており、実際にin vitroでCDKによってリン酸化されることが報告されているものであった。今後はこれらの候補蛋白質で、Clb2とリン酸化依存的に結合するものがあるかどうか調べていく予定である。高等真核生物でもサイクリンにリン酸化依存的に結合する蛋白質を同定する目的で、レトロウイルス発現系を用いて野生型サイクリンB1、あるいは、リン酸化依存的結合のない変異型サイクリンB1を恒常的に発現する細胞株を得ることに成功した。今後はこれらのサイクリンに結合する蛋白質を生化学的に単離し質量分析を用いた同定を行っていく予定である。

真核生物的细胞周期由CDK（细胞周期蛋白依赖性激酶）的活性控制。 CDK 的激酶活性通过调节因子细胞周期蛋白的结合而被激活。 CDK磷酸化位点的常见序列是非常简单的S/TPXK/R，据报道它实际上在体外磷酸化许多底物蛋白。然而，CDK 的直接细胞内靶分子很大程度上未知。我之前发现酿酒酵母的细胞周期蛋白Clb2以磷酸化依赖性方式与底物Cdc6结合。本研究重点关注细胞周期蛋白的这一新功能，并通过寻找 CDK 底物（其活性通过以磷酸化依赖性方式与细胞周期蛋白结合来调节）为细胞周期研究做出贡献。首先，我们尝试使用酿酒酵母双杂交系统分离与酿酒酵母 Clb2 结合的蛋白质。当我们使用野生型 CLB2 基因作为诱饵时，我们发现细胞增殖几乎被抑制，因此当我们使用不能与 CDK 结合但能够磷酸化依赖性结合的 KAEAFA 突变体时，我们发现 10 我们能够分离出几个候选基因。其中一些具有 CDK 磷酸化位点，并且据报道在体外实际上被 CDK 磷酸化。将来，我们计划研究这些候选蛋白是否以磷酸化依赖性方式与 Clb2 结合。为了鉴定高等真核生物中以磷酸化依赖性方式与细胞周期蛋白结合的蛋白质，我们使用逆转录病毒表达系统组成型产生野生型细胞周期蛋白B1或不以磷酸化依赖性方式与细胞周期蛋白结合的突变型细胞周期蛋白B1我们成功获得了表达细胞系。将来，我们计划通过生化方法分离与这些细胞周期蛋白结合的蛋白质，并使用质谱法对其进行鉴定。