細胞運動のレドックス調節機構の研究

细胞运动氧化还原调控机制研究

基本信息

批准号：
18870003
负责人：
若林憲一
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

[本年度の成果]i)変異を導入したダイニン型チオレドキシンLC3/LC5による基質トラップ前年度までに作成した、活性部位のCysをSerに変異させたLC3とLC5のcDNAを、クラミドモナス野生株に導入した。変異チオレドキシンはジスルフィド結合を介して基質をトラップすることができる。この際、前年度に基質の収率が悪かったHA-tagではなく6xHis-tagを融合させた。しかし、明らかに非特異的と思われるタンパク質をトラップしたため、この方法をとりやめ、HA-tagで発現量の多い形質転換体を再スクリーニングした。現在、それらの株を用いてLC3/LC5-基質の複合体の精製を試みている。ii)チオレドキシン還元酵素(TR)の鞭毛での存在の確認チオレドキシンだけでなく、その他のレドックス関連タンパク質の鞭毛内での振る舞いを知るべく、TRに着目した。鞭毛内にはダイニン型チオレドキシンが存在するのに、その活性維持に欠かせないTRが鞭毛プロテオームに記載されていなかった。私はクラミドモナスのESTデータベースを検索し、いくつかのTRのうち細胞質性TRであるTR1に着目し、抗体を作成した。するとたしかに鞭毛の細胞質に局在していることがわかった。[重要性など]i)はチオレドキシン配列とHis-tagの相性の悪さなど予想外の困難があったが、近日中に基質を同定できる予定である。同定できた暁には、モータータンパク質の機能の理解に新しい切り口を提供するはずである。ii)は、鞭毛内に機能的なチオレドキシンが存在することの証左となる。もしも細胞質型チオレドキシンと相互作用するTR1がLC3,LC5とも相互作用するならば、異なるファミリーのチオレドキシンが同一のTRで活性を保つことになり、新たなレドックス・シグナリング経路が発見できたことになる。

[今年的结果] i）将用动力蛋白型硫氧还蛋白LC3/LC5捕获，其突变活性位点Cys to Ser（由上一年生产）引入了衣原体野生菌株中。突变硫蛋白能够通过二硫键捕获底物。在这种情况下，将6xhis-tag融合而不是HA-TAG，前一年的底物产量较差。但是，由于显然不是特异性的蛋白质被捕获，因此停止了这种方法，并用HA-TAG将具有高表达水平的转化子重新归化。当前，这些菌株被用于净化LC3/LC5-Substrate复合物。 ii）确认鞭毛中硫氧还蛋白还原酶（TR）的存在，我们专注于TR，以找出不仅硫氧还蛋白和其他氧化还原相关的蛋白质的行为。尽管鞭毛中存在动力蛋白型硫氧还蛋白，但鞭毛蛋白质组并未描述TR，这对于维持其活性至关重要。我搜索了EST数据库中的衣原体，并通过专注于TR1（一种TR1），这是一种抗体，这是一种细胞质TR。发现它确实位于鞭毛的细胞质中。 i）i）遇到了意外的困难，例如硫氧还蛋白序列和HIS标签的不兼容，但很快就会确定底物。一旦确定，它应该提供一种新的方法来理解运动蛋白的功能。 ii）是鞭毛中存在功能性硫氧还蛋白的证据。如果与细胞质硫氧还蛋白相互作用的TR1与LC3和LC5相互作用，则不同的硫氧还蛋白家族保持活跃，并在相同的TR中保持活跃，从而发现了新的氧化还原信号传导途径。