末梢神経端側縫合部における側副神経軸索誘導の分子機構の解明

阐明周围神经终末缝侧副神经轴突引导的分子机制

基本信息

批准号：
17791277
负责人：
辻隆治
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17791277/
关键词：
神経再生 FLRT3 知覚神経再生端側吻合掻痒

项目摘要

FLRT3遺伝子よりシグナルシークエンスを除いた全長を、Nに6×HISタグをもつpET100ベクター(インビトロジェン)に組み込み、BL21内にて発現を行った。培養のライセートをXpress(インビトロジェン)タグに対する抗体でウェスタンブロットを行いFLRT3リコンビナントタンパクの発現の確認を行ったが、IPTGの誘導時より分解産物のバンドがみられた。発現タンパクの誘導を緩慢に行い、分解を抑えるように、培養温度を段階的に37度から、30度、25度、20度と低温にしたが、同様であった。さらに、IPTG濃度を1mMから、0.5mM、0.1mMをそれぞれの培養条件で行ったが、シングルバンドの増強は得られなかった。さらに培地を2×YT、LB,グルコースの添加、抗生物質をアンピシリンから、カルベニシリンへ変更を行った。しかし、結局、全長でのシングルバンドの発現は得られなかった。これらをNTAゲルにて粗生成を行い、MonoQカラム、ゲルろ過にてシングルバンドになるよう試みたが、分解産物は複数あり、どの部分で分解されるのかは特定できなかった。このため、短いフラグメントの作製することにした。FLRT3にはN末からシグナル配列、LRリピート、フィブロネクチン3類似ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、細胞内ドメインが存在する。まずは、FLRT3の細胞外ドメイン、LRリピートドメイン、フィブロネクチン3類似ドメインに分けて、pET100ベクターに組み込んだ。

将FLRT3基因的整个长度（不包括信号序列）掺入了PET100矢量（Invitrogen）中，并在N处为6×HIS标签，并在BL21中表达。将培养的裂解物用针对XPRESS（Invitrogen）标签的抗体进行蛋白质印迹，以确认FLRT3重组蛋白的表达，但是当诱导IPTG时观察到了一系列降解产物。培养温度从37°C逐渐降低至30°C，25°C和20°C，以减慢蛋白质表达并抑制降解，但也是如此。此外，在各自的培养条件下，IPTG浓度从1 mm到0.5 mm，0.1 mM，但没有获得单个带的增强。此外，添加培养基2×YT，LB和葡萄糖，并将抗生素从氨苄西林转换为氨基苯甲林。但是，最后，单个频段的表达尚未实现。这些是用NTA凝胶粗暴产生的，并尝试使用Monoq柱和凝胶过滤来形成单个谱带，但是有多种降解产物，因此无法确定降解的部分。因此，我们决定做一个简短的片段。 FLRT3具有来自N末端，LR重复序列，纤连蛋白-3样结构域，跨膜结构域和细胞内结构域的信号序列。首先，将细胞分为FLRT3，LR重复结构域和纤连蛋白3相似域的细胞外结构域，并将其掺入PET100载体中。