2プロモーター型ベクターを利用した遺伝子治療の分子イメージング法の開発

使用2-启动子载体开发基因治疗的分子成像方法

基本信息

批准号：
17790857
负责人：
清野泰
金额：
$ 2.18万
依托单位：
University of Fukui (2006)Kyoto University (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子治療における導入遺伝子の発現を非侵的に評価する方法の開発を目的として、「2プロモーター型ベクター」という新しい戦略のもとに、心不全の治療遺伝子を導入し、その遺伝子の発現を非侵襲的にイメージングすることを計画した。本年度は、引き続き治療遺伝子として心臓のβ受容体のシグナル伝達を脱感作するGタンパク質共役型受容体キナーゼ(GRK)を阻害するβARKctを、レポーター遺伝子として1塩基置換したdopamine trnasporter(mDAT)を同時に発現する2-プロモーター型ベクターの構築及び構築したベクターのインビトロ実験系での評価を行った。まずラットの心臓及び脳よりβARKctとDAT遺伝子のcDNAを作製した。次いで、両遺伝子を2-プロモーター型ベクターに挿入することにより、両タンパク質を同時に発現する2-プロモーター型ベクターを構築した。さらに、臨床への応用を考え、DATを細胞に発現させたときにdopamineを細胞内に取り込み生理反応を引き起こさないようにするために、dopamineの取込能を消失させたmDATの作製も行った。DATアミノ酸配列中、101番目のプロリンをアラニンに変換する点変異を導入することによりmDATを作製した。構築したベクターをHEK293細胞に導入し、インビトロ実験系における検討を行った。その結果、βARKctとmDATタンパク質の発現をwesternblot法により確認できた。さらに構築したベクターを導入した細胞においてβ受容体のシグナル伝達を阻害できること、dopamine取込能が消失していることを確認した。さらにDATに対する分子イメージングプローブの結合能が維持されていることも確認した。本ベクターを用いることにより、インビボにおいて心木全治療と治療遺伝子の発現をイメージングできる可能性が示唆された。

为了开发一种非侵入性评估基因治疗中转基因表达的方法，我们基于称为“双启动子载体”的新策略引入了心力衰竭治疗基因，并非侵入性地评估了该基因的表达我们计划对图像进行详细成像。今年，我们将继续开发作为治疗基因的βARKct和多巴胺转运蛋白（mDAT），βARKct可抑制G蛋白偶联受体激酶（GRK）（使心脏β受体信号传递脱敏），而多巴胺转运蛋白（mDAT）具有单碱基取代，作为报告基因，我们构建了用于表达的2-启动子型载体，并在体外实验系统中评估了构建的载体。首先，从大鼠心脏和大脑中产生βARKct和DAT基因的cDNA。接下来，通过将两个基因插入到2-启动子载体中，构建了同时表达两种蛋白质的2-启动子载体。此外，考虑到临床应用，我们创造了不具有多巴胺摄取能力的mDAT，以防止DAT在细胞中表达时多巴胺被摄入细胞并引起生理反应。 mDAT 是通过引入点突变而创建的，该点突变将 DAT 氨基酸序列中第 101 位的脯氨酸转化为丙氨酸。将构建的载体导入HEK293细胞并在体外实验系统中进行研究。结果，通过westernblot方法证实了βARKct和mDAT蛋白的表达。此外，我们证实，在导入了构建的载体的细胞中，β受体信号转导受到抑制，多巴胺摄取能力丧失。此外，我们证实分子成像探针与 DAT 的结合能力得以维持。该载体的使用表明了对整个心脏树治疗和体内治疗基因表达进行成像的可能性。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Synthesis and evaluation of radioiodinated (S,S)-2-(alpha-(2-iodophenoxy)benzyl)morpholine for imaging brain norepinephrine transporter.

用于脑去甲肾上腺素转运蛋白成像的放射性碘化 (S,S)-2-(α-(2-碘苯氧基)苄基)吗啉的合成和评价。

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 33・6
影响因子：
0
作者：
小坂信之;他;Yasushi Kiyono;Yasushi Kiyono
通讯作者：
Yasushi Kiyono

Vla Vasopressin receptors maintain normal blood pressure by regulating circulating blood volume and baroreflex sensitivity.

Vla 加压素受体通过调节循环血量和压力反射敏感性来维持正常血压。

DOI：
发表时间：
期刊：
Proc.Natl.Acad.Sci.USA. (印刷中)
影响因子：
0
作者：
M.Isaji et al.;H.Wang et al.;N.Yamada et al.;H.Ueno et al.;H.Tanahashi et al.;Okuno Y;Adachi T;Ishida A;Hosoda C;Zhu S;Lazaro-Suarez ML;Kagaya S;Zacharia J;Sugimoto Y;Nagata N;Egashira N;Kagaya S;Chen Q;Erami C;Katsuma S;Adachi T;Katsuma S;Yamada M;Yamauchi J;Hosoda C;Adachi T;Katsuma S;Deighan C;Hirasawa A;Ami Y;Koshimizu T
通讯作者：
Koshimizu T

GammadeltaT cells kill myeloma cells by sensing mevalonate metabolites and ICAM-1 molecules on cell surface.

GammadeltaT 细胞通过感知细胞表面的甲羟戊酸代谢物和 ICAM-1 分子来杀死骨髓瘤细胞。