アルブミン遺伝多型を利用した抗酸化型組換えアルブミンの分子設計

利用白蛋白遗传多态性进行抗氧化型重组白蛋白的分子设计

• 批准号: 17790127
• 负责人: 安楽 誠
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790127/
• 关键词: アルブミン; 遺伝子組換え; 抗酸化能; 体内動態; システイン残基; 抗原性; 構造特性; メチオニン残基; 臨床応用; アルブミン; 遺伝子組換え; 抗酸化能; 体内動態; システイン残基; 抗原性; 構造特性; メチオニン残基; 臨床応用

本研究は,当研究室において構築された遺伝子組換え技術を基に,安全性及び有効性に優れた,特に抗酸化能を有するアルブミン製剤を開発することを目的として企図された.抗原性を考慮して,ヒト異型アルブミン(variant)に着目し,1残基置換variantの抗酸化能を評価した.その結果,ヒト血清アルブミン(HSA)の抗酸化能に関与するアミノ酸残基として,^3His,^<122>Val,^<410>Arg及び^<505>Gluが,HSA自身の構造及び機能を維持する上で必須なアミノ酸残基として機能している可能性が強く示唆された.そこで,特に抗酸化能が顕著であった^<410>ArgをCysに変異したvariant R410Cに着目し,yeast-E.coliのシャトルベクターpHIL-D2上でAOX1のプロモーター下流にシグナル配列とポリA配列を含むHSAcDNAを挿入した発現ベクターを作製し,部位特異的に変異させた後(^<410>ArgをCysに置換),このベクターでPichia pastoris(GS115株)を形質転換し,BMMY培地培養後,培地上清より60%硫安分画により濃縮を行い,Blue Sepharose CL-6Bを用い,R410Cを精製した.アルブミンミュータントR410Cにおいて,その構造・体内動態特性について検討した結果,CDスペクトル法により,変異による構造変化は観察されなかった.また,ラットにR410Cを静脈内投与し血中半減期を検討した結果,血漿由来のアルブミン(pHSA)と比較して若干の消失の促進が観察された.以上の結果から,遺伝子組換えアルブミンとして設計されたR410Cは,ヒト由来のvariantであるため,抗原性の心配がないことに加えて,抗酸化能という新たな機能を有したアルブミン製剤として機能する可能性が強く示唆された.

这项研究旨在根据我们实验室中构建的基因重组技术开发具有出色安全性和有效性的白蛋白配方，尤其是抗氧化特性。考虑到抗原性，我们专注于人类非典型白蛋白（变体），并评估了1-残基替代变体的抗氧化能力。结果，强烈建议 ^3his， ^<122> val， ^<410> arg和 ^<505> glu，作为人血清白蛋白（HSA）抗氧化能力的氨基酸残基，可能是维持HSA本身的结构和功能所必需的氨基酸残基。因此，将特别明显的抗氧化能力的变体突变为Cys。 Focusing on R410C, an expression vector was prepared in which HSAcDNA containing the signal sequence and polyA sequence was inserted downstream of the promoter of AOX1 on the shuttle vector pHIL-D2 of yeast-E.coli, and after site-specific mutation (^<410>Arg is replaced with Cys), Pichia pastoris (strain GS115) was transformed with this vector, and after culture of BMMY培养基，将混合物通过硫酸铵从中清液中浓缩，并使用CL-6B纯化蓝色的Sepharose R410C。通过检查白蛋白突变体R410C的结构和体内动力学特性，未观察到通过CD光谱观察到突变引起的结构变化。此外，当R410C静脉内给大鼠施用R410C并检查了血液的半衰期时，与血浆衍生的白蛋白（PHSA）相比，观察到消失的略有增加。上述结果强烈表明，R410C被设计为人类变体，是人类的变体，除了不关心抗原性外，它还可以用作白蛋白制剂，具有抗氧化能力的新功能。