ヌクレオチド除去修復におけるDDBの機能とクロマチン構造変換機構の解析

核苷酸切除修复中DDB功能及染色质结构转换机制分析

基本信息

  • 批准号:
    16710031
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.11万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
  • 财政年份:
    2004
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2004 至 2005
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

ヌクレオチド除去修復反応におけるDDBの機能とクロマチン構造変換機構を明らかにするために、以下の点について解析を行った。まず、昨年度解析したDDBと相互作用するヒストンアセチルトランスフェラーゼに加え、クロマチンの構造変換に関わるATP依存性クロマチンリモデリング因子の修復反応への関与について検討した。出芽酵母のATP依存性クロマチンリモデリング因子の一つであるIno80複合体は、その欠損体が紫外線を含む種々のDNA傷害剤に対して高感受性を示すことが知られている。最近になり、ATPase活性を担うIno80サブユニットのホモログ(hIno80)がヒトにおいても存在することがわかったので、cDNAを入手して外来発現系を構築した。ヒト細胞内でhIno80を発現後、局所的紫外線照射法により核の一部にDNA損傷を誘起し、蛍光免疫染色によりその局在性を解析した。しかし、ヌクレオチド除去修復の基本修復因子やDDBとは異なり、DNA損傷部位への集積は観察されなかった。また、SWI/SNF複合体のサブユニットについても検討したが、DNA損傷部位に集積することはなかった。また、DDBの機能を明らかにするために、DDBのサブユニットのうち自然に変異体が存在しないDDB1のノックアウト細胞の作成を行った。ニワトリDT40細胞を用いた通常のターゲッティングでは、ホモ接合体細胞を得ることはできなかったが、コンディショナルミュータントの作成に成功した。そして、細胞内のDDB1タンパク質を消失させると、細胞周期のS期の進行に異常を生じ、増殖が遅延して、最終的に死に至ることがわかった。さらに、siRNAを用いてDDB1を欠損させたヒト細胞も同様な表現型を示すことを見いだし、DDB1が細胞の生存に欠くことのできない重要な機能をもっことを明らかにした。
为了阐明DDB在核苷酸切除修复反应和染色质结构转化的机理中的功能,分析了以下几点。首先,除了去年对DDB相互作用的组蛋白乙酰转移酶外,我们还研究了与ATP依赖性染色质重塑因子的参与,涉及染色质结构转化在修复反应中。 INO80复合物是萌芽酵母中ATP依赖性染色质重塑因子之一,已知对各种DNA损伤剂(包括紫外线)高度敏感。最近,人们发现人类中还存在负责ATPase活性的INO80亚基(Hino80)的同源物,因此获得了cDNA来构建外国表达系统。在人类细胞中表达Hino80后,通过局部紫外线照射在一部分核中诱导DNA损伤,并通过荧光免疫染色分析其定位。但是,与核苷酸切除修复的基本修复因子和DDB不同,在DNA损伤部位未积累。我们还研究了SWI/SNF复合物的亚基,但没有在DNA损伤部位积聚。此外,为了阐明DDB的功能,我们创建了DDB1的基因敲除细胞,其中DDB亚基之间没有天然突变体。尽管无法使用鸡DT40细胞的正常靶向获得纯合体细胞,但我们能够创建有条件的突变体。发现DDB1蛋白在细胞中的消失导致细胞周期S相进展的异常,从而延迟增殖并最终导致死亡。此外,我们发现使用siRNA缺乏DDB1缺乏的人类细胞也表现出类似的表型,表明DDB1具有重要的功能,这对于细胞存活至关重要。

项目成果

期刊论文数量(2)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Human XPC-HR23B interacts with XPA-RPA in the recognition of triplex-directed psoralen DNA interstrand crosslinks.
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2005
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Thoma;B.S.;Wakasugi M.;Christensen;J.;Reddy;M.C.;Vasquez;K.M.
  • 通讯作者:
    K.M.
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