ヌクレオチド除去修復におけるDDBの機能とクロマチン構造変換機構の解析

核苷酸切除修复中DDB功能及染色质结构转换机制分析

基本信息

批准号：
16710031
负责人：
若杉光生
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ヌクレオチド除去修復反応におけるDDBの機能とクロマチン構造変換機構を明らかにするために、以下の点について解析を行った。まず、昨年度解析したDDBと相互作用するヒストンアセチルトランスフェラーゼに加え、クロマチンの構造変換に関わるATP依存性クロマチンリモデリング因子の修復反応への関与について検討した。出芽酵母のATP依存性クロマチンリモデリング因子の一つであるIno80複合体は、その欠損体が紫外線を含む種々のDNA傷害剤に対して高感受性を示すことが知られている。最近になり、ATPase活性を担うIno80サブユニットのホモログ(hIno80)がヒトにおいても存在することがわかったので、cDNAを入手して外来発現系を構築した。ヒト細胞内でhIno80を発現後、局所的紫外線照射法により核の一部にDNA損傷を誘起し、蛍光免疫染色によりその局在性を解析した。しかし、ヌクレオチド除去修復の基本修復因子やDDBとは異なり、DNA損傷部位への集積は観察されなかった。また、SWI/SNF複合体のサブユニットについても検討したが、DNA損傷部位に集積することはなかった。また、DDBの機能を明らかにするために、DDBのサブユニットのうち自然に変異体が存在しないDDB1のノックアウト細胞の作成を行った。ニワトリDT40細胞を用いた通常のターゲッティングでは、ホモ接合体細胞を得ることはできなかったが、コンディショナルミュータントの作成に成功した。そして、細胞内のDDB1タンパク質を消失させると、細胞周期のS期の進行に異常を生じ、増殖が遅延して、最終的に死に至ることがわかった。さらに、siRNAを用いてDDB1を欠損させたヒト細胞も同様な表現型を示すことを見いだし、DDB1が細胞の生存に欠くことのできない重要な機能をもっことを明らかにした。

为了阐明DDB的功能以及核苷酸切除修复反应中染色质结构转变的机制，我们分析了以下几点。首先，除了我们去年分析的与 DDB 相互作用的组蛋白乙酰转移酶之外，我们还研究了 ATP 依赖性染色质重塑因子（参与染色质结构变化）在修复反应中的参与情况。众所周知，Ino80 复合体的缺陷形式是酿酒酵母中一种 ATP 依赖性染色质重塑因子，对包括紫外线在内的各种 DNA 损伤剂高度敏感。最近，我们发现人体中存在负责ATPase活性的Ino80亚基（hIno80）的同源物，因此我们获得了cDNA并构建了外源表达系统。在人类细胞中表达hIno80后，我们通过局部紫外线照射诱导部分细胞核的DNA损伤，并通过荧光免疫染色分析其定位。然而，与核苷酸切除修复和DDB的基本修复因子不同，没有观察到在DNA损伤位点的积累。我们还研究了 SWI/SNF 复合体的亚基，但它们并未在 DNA 损伤位点积累。此外，为了阐明 DDB 的功能，我们创建了 DDB1 敲除细胞，DDB1 是 DDB 的一个亚基，其中不存在天然存在的突变体。尽管使用鸡 DT40 细胞的常规靶向不可能获得纯合细胞，但我们成功地创建了条件突变体。他们发现，删除细胞中的 DDB1 蛋白会导致细胞周期 S 期进展异常，阻碍增殖并最终导致死亡。此外，他们发现使用siRNA删除DDB1的人类细胞表现出相似的表型，这表明DDB1具有细胞生存不可或缺的重要功能。