ゼブラフィッシュ神経回路可視化系を用いたシナプス形成誘導分子の探索、同定

使用斑马鱼神经回路可视化系统搜索和识别诱导突触发生的分子

基本信息

批准号：
16700319
负责人：
吉田知之
金额：
$ 2.37万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ラット胎児脳抽出物からショ糖密度勾配遠心法によりlight membrane画分を得た。この画分に対して2種類のアクティブゾーン蛋白質に対する抗体を用いて免疫沈降を行い、アクティブゾーン前駆小胞を独立に濃縮した。これらをSDS-PAGEで展開し、銀染色したところコントロールに対して2種類の抗アクティブゾーン蛋白質抗体特異的に共沈するバンドが20程度得られた。今後、これらの蛋白質を質量分解により同定し、シナプス形成における機能を解析する予定である。また、上記で得られる分子がシナプス形成においてどのような働きを持つのかを調べるため、GAP43-EGFPで可視化したゼブラフィッシュ嗅神経細胞軸索終末の構造変化やVAMP2-EGFPを用いて可視化したシナプス小胞の集積の変化を指標とした機能解析系を作製した。この系を用いることにより恒常不活性化型PKA及びCREBの発現がVAMP2-EGFPの軸索終末への集積を抑制し、一方、恒常活性化型PKA及びCREBの発現がそれを促進することがわかった。一方、カルシニューリン阻害薬を投与すると軸索終末の膜構造の変化が抑えられ、カルシニューリンによるNFATの活性化を阻害するペプチドを発現することによっても同様に軸索終末の膜構造の変化が抑えられたため、カルシニューリン-NFATシグナルが軸索終末の膜構造の変化を調節することが分かった。これらの結果より、軸索終末の分化をPKA-CREBシグナルとカルシニューリン-NFATシグナルが独立に調節することが示唆された。この成果はJournal of Neuroscience25(12):3067-3079に掲載された。またプレシナプスに局在するb-ニューレキシンがこれらの膜構造の変化、シナプス小胞の集積のうち後者を選択的に調節することを見いだした。この成果は現在投稿中である。

通过蔗糖密度梯度离心从大鼠胎脑提取物中获得轻膜级分。使用针对两种类型的活性区蛋白的抗体对该级分进行免疫沉淀，并且独立地富集活性区前体囊泡。当通过 SDS-PAGE 显色并银染时，与对照相比，获得了约 20 个与两种类型的抗活性区蛋白抗体特异性共沉淀的条带。未来，我们计划通过质量分辨率鉴定这些蛋白质并分析它们在突触形成中的功能。此外，为了研究上面获得的分子在突触形成中的作用，我们研究了用 GAP43-EGFP 可视化的斑马鱼嗅觉神经元轴突末端的结构变化和用 VAMP2-EGFP 可视化的小突触，我们使用变化创建了一个功能分析系统。以细胞积累为指标。使用该系统，我们发现组成型失活的 PKA 和 CREB 的表达抑制 VAMP2-EGFP 在轴突末端的积累，而组成型激活的 PKA 和 CREB 的表达则促进 Ta 的积累。另一方面，钙调磷酸酶抑制剂的施用抑制了轴突末端的膜结构的变化，并且通过钙调磷酸酶抑制NFAT激活的肽的表达也抑制了轴突末端的膜结构的变化，发现钙调磷酸酶-NFAT信号。调节轴突末端膜结构的变化。这些结果表明 PKA-CREB 和钙调神经磷酸酶-NFAT 信号独立调节轴突终末分化。该结果发表在Journal of Neuroscience25(12):3067-3079上。我们还发现，位于突触前的 b-neurexin 选择性地调节膜结构的后者变化和突触小泡的积累。目前该结果正在提交中。