IgA腎症患者の口蓋扁桃におけるToll-likeレセプター発現の検討

IgA肾病患者腭扁桃体Toll样受体表达的检测

基本信息

批准号：
16790993
负责人：
須長寛
金额：
$ 2.18万
依托单位：
University of Fukui
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790993/
关键词：
IgA腎症口蓋扁桃 Toll-like receptor 単核細胞サイトカイン TLR RT-PCR

项目摘要

1.口蓋扁桃におけるTLR発現の検討対象は腎生検にて確定診断され、扁桃摘出術を受けたIgA腎症患者および非IgA腎症患者(慢性扁桃炎、扁桃肥大)である。これまでに手術的に得られた口蓋扁桃が凍結保存されており、これらを用いて実験を行う。なお、患者からこれらの扁桃組織に関して手術前に採取組織の研究使用に対する同意書を得ている。まず、扁桃組織からmRNAを抽出し、RT-PCR法にて遺伝子レベルでのTLR2,3,4,5,9の発現をリアルタイムPCRにて定量した。TLR3においてIgA腎症では慢性扁桃炎に比べて有意に発現が少なかったが、他のTLRでは両者の間に優位な差は見られなかった。TLR9は他のTLRに比べて有意にその発現が多く認められた。2.リガンド刺激による扁桃単核細胞におけるIgA、サイトカインの産生についてTLRに対するリガンドを用いて扁桃単核細胞を刺激する。各種TLRのリガンドとしてインフルエンザ菌外膜抗原とマイコプラズマのリポペプチド、G(+)菌のペプチドグリカン、G(-)菌のLPS、細菌の鞭毛のフラジェリン、CpG DNAやウイルスのdsRNAを用いる。扁桃単核細胞は、手術的に得られた扁桃を機械的に破砕しメッシュで処理した後にFicoll-Hypaqueを用いて単核細胞を遠心分離して得られる。分離した細胞をリガンドと共にRPMIで培養した後、上清中のIgA、IgA産生に関与するサイトカイン(IL-10,TGF-β,IFN-γ)をELISAを用いて測定した。まず、IgAやサイトカイン産生についてインフルエンザ菌外膜抗原単独刺激を行った。IgA腎症患者の扁桃細胞は、IgAおよびIL-10、TGF-βの産生が非IgA腎症患者の扁桃細胞よりも有意に増加していた。3.TLRを介したリガンド刺激におけるIgA産生亢進に関するシグナル伝達機序の検討リガンド刺激によりTLRのシグナル伝達経路であるTRAFおよびNF-κBの活性化をウェスタンブロット法にて検討した。また、TLRへのリガンドの結合によりJNKの活性化が知られており、MAPキナーゼを介したシグナル伝達系としてp38、JNK、ERK5のリン酸化について免疫沈降法にて確認した。

1.腭扁桃体TLR表达的调查对象为经肾活检确诊并行扁桃体切除术的IgA肾病患者和非IgA肾病患者（慢性扁桃体炎、扁桃体肥大）。迄今为止，手术获得的腭扁桃体已被冷冻保存，并将用于实验。此外，在手术前还获得了患者对收集的扁桃体组织进行研究用途的书面同意。首先，从扁桃体组织中提取mRNA，并使用实时PCR通过RT-PCR对基因水平的TLR2、3、4、5和9的表达进行定量。 TLR3在IgA肾病中的表达显着低于慢性扁桃体炎，但在其他TLR中两者之间没有观察到显着差异。 TLR9 的表达明显高于其他 TLR。 2.配体刺激扁桃体单核细胞产生 IgA 和细胞因子。使用 TLR 配体刺激扁桃体单核细胞。作为各种 TLR 的配体，我们使用流感嗜血杆菌外膜抗原、支原体脂肽、来自 G(+) 细菌的肽聚糖、来自 G(-) 细菌的 LPS、来自细菌鞭毛的鞭毛蛋白、CpG DNA 和病毒 dsRNA。通过机械粉碎手术获得的扁桃体，用网处理它们，然后使用 Ficoll-Hypaque 离心单核细胞，获得扁桃体单核细胞。在RPMI中用配体培养分离的细胞后，使用ELISA测定上清液中的IgA和参与IgA产生的细胞因子(IL-10、TGF-β、IFN-γ)。首先，我们单独刺激流感嗜血杆菌外膜抗原以产生 IgA 和细胞因子。与非 IgA 肾病患者相比，IgA 肾病患者的扁桃体细胞 IgA、IL-10 和 TGF-β 的产生显着增加。 3.检查与TLR介导的配体刺激后IgA产生增强相关的信号转导机制我们使用Western blotting检查了配体刺激对TLR信号转导途径TRAF和NF-κB的激活。此外，已知JNK通过配体与TLR的结合而被激活，并且通过免疫沉淀证实了作为MAP激酶介导的信号转导系统的p38、JNK和ERK5的磷酸化。