ES細胞特異的新規RasファミリータンパクERasの神経芽腫悪性化への関与

ES细胞特异性新型Ras家族蛋白ERas参与神经母细胞瘤恶性转化

基本信息

批准号：
16790584
负责人：
青山峰芳
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790584/
关键词：
ERas 神経芽腫薬剤耐性 AKT

项目摘要

本年度は、ES細胞特異的に発現している新規遺伝子ERasの発現を実際の神経芽腫摘出標本で確認し、腫瘍細胞株を用いてERas発現による腫瘍形成能、薬剤感受性の変化について解析した。1,神経芽腫摘出標本でのERasタンパクの発現患者または患者家族から遺伝子およびタンパク発現の解析について同意を得た神経芽腫患者摘出腫瘍切片を用いて免疫染色によりタンパクレベルでの発現を確認した。抗体は研究協力者の山中らがすでに作成し、特異性を確認できている抗ERas抗体を用いた。今回用いたほとんどすべての神経芽腫切片で発現を確認したが、特に未分化な腫瘍細胞ほど強い染色性を示した。また、ERasタンパクは細胞内の細胞膜に局在していると考えられた。2,神経芽腫細胞株でのERasの発現神経芽腫細胞株では複数の細胞株でERas遺伝子の発現をRT-PCRによって確認していたが、Western blottingによってタンパクレベルでの発現も同時に確認できた。3,神経芽腫ERas遺伝子強制発現株の解析ERas発現が確認できている中でも低発現である神経芽腫細胞株SH-SY5Yを用いてERas遺伝子を導入し強制発現株を作成した。これらのクローン細胞株は細胞増殖能に影響は与えない一方で、soft agarを用いた足場非依存性の増殖を亢進し、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ビンブラスチンといった神経芽腫への化学療法剤による細胞死を抑制した。この薬剤耐性のメカニズムにはERas発現による下流シグナル分子のリン酸化を介したERas/Akt pathwayの活性化が重要な働きをしている可能性が示唆された。

今年，我们在实际的神经母细胞瘤切除标本中证实了ES细胞中特异性表达的新基因ERas的表达，并利用肿瘤细胞系分析了由于ERas表达引起的致瘤性和药物敏感性的变化。 1.神经母细胞瘤切除标本中ERas蛋白的表达通过使用来自神经母细胞瘤患者的肿瘤切片的免疫染色来证实蛋白水平的表达，所述患者或患者家属同意进行基因和蛋白表达分析。使用的抗体是研究合作者Yamanaka等人已经创建的抗ERas抗体，其特异性已得到证实。在本研究中使用的几乎所有神经母细胞瘤切片中都证实了表达，并且在未分化的肿瘤细胞中染色特别强。此外，ERas 蛋白被认为位于细胞膜内。 2.ERas在神经母细胞瘤细胞系中的表达RT-PCR证实ERas基因在多种神经母细胞瘤细胞系中表达，但Western blotting无法同时证实ERas基因在蛋白水平的表达。 3.神经母细胞瘤ERas基因强制表达株的分析我们利用ERas低表达水平的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，导入ERas基因，构建了强制表达株。虽然这些克隆细胞系对细胞增殖能力没有影响，但它们使用软琼脂增强了贴壁依赖性增殖，并且细胞受到神经母细胞瘤化疗药物（如顺铂、阿霉素、依托泊苷和长春花碱）的刺激，抑制了死亡。 ERas表达磷酸化下游信号分子从而激活ERas/Akt通路可能在耐药机制中发挥重要作用。