コンビナトリアルバイオトランスフォーメーションによる低副作用医薬品の開発

通过组合生物转化开发低副作用药物

基本信息

批准号：
16790014
负责人：
下田恵
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Oita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に引き続き低副作用医薬品の開発を目的として、前年度開発したスラリー型リアクターによりステロイド系ならびにクマリン系生理活性化合物の変換を行った。今年度は反応触媒としてタバコ培養細胞を用い、混合酵素系としての生体触媒によるバイオトランスフォーメーション技術の低副用医薬品開発への展開を試みた。(1)タバコ懸濁培養細胞系スラリー型リアクターによる11,20-ジヒドロキシステロイドの変換タバコの液体懸濁培養細胞を充填したスラリー型リアクターに、基質として11,20-ジヒドロキシステロイドを培養細胞1kgに対し2〜10g添加して5日間インキュベートを行った。反応生成物は細胞メタノール浸漬の後に酢酸エチル分画を行い、各種クロマトグラフィーにより精製を行った。変換生成物のマスおよびNMRスペクトル解析を行った結果、目的のジアステレオマーが高い光学純度99%で得られることが分かった。また、逆加水分解反応だけでなく酸化反応や異性化反応が生起しており、基質投与量が少量の場合には酸化反応が進行し目的反応の進行がえられることが分かった。(2)タバコ懸濁培養細胞系スラリー型リアクターによるヒドロキシクマリンの変換基質としてヒドロキシクマリンを培養細胞1kgに対し2〜10g添加して変換反応を行った場合には、逆加水分解反応が進行し、酸化反応の進行は遅く異性化反応はみられなかった。次に、それぞれの反応に関与している酵素蛋白質レベルによる11,20-ジヒドロキシステロイドおよびヒドロキシクマリンの基質特異性を調べた。酵素系の精製はタバコ粗酵素画分をイオン交換カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、アフィニティーカラムの各種クロマトグラフィーにより行った。反応は基質5mM及び補酵素10mMを、精製した酸化酵素溶液に添加して24時間37℃でインキュベートすることにより行った。その結果、酸化酵素は11,20-ジヒドロキシステロイドを特異的に変換し、これら基質におけるリアクターの反応性の違いは酸化酵素の基質特異性によることが明らかになった。

从上一年开始，为了开发低层有效的药物，基于类固醇和香豆素的生物活性化合物使用去年开发的浆液型反应器进行了转化。今年，我们试图使用培养的烟草细胞作为反应催化剂，生物转化技术使用生物催化技术作为混合酶系统开发低增生药物。（1）使用含有液体悬浮的烟草细胞的浆液型反应器将11,20-二羟基固醇转化，将2-10 g的11,20-2-20 g添加为1 kg培养细胞的底物，并孵化5天。将反应产物浸入甲醇中，然后分解乙酸乙酯，并通过各种色谱纯化。转换产物的质量和NMR光谱分析表明，靶标映异构体的高光纯度为99％。还发现，不仅是逆水解反应，而且还会发生氧化和异构反应，并且当底物剂量很小时，氧化反应会进展，从而可以进行靶反应。（2）当将2-10克羟基丙糖蛋白添加到1 kg培养的细胞中，作为溶液型悬浮培养物中的浆液型反应器作为羟基丙酸酯的转化底物，反水解反应反应的反反应反应，氧化反应进展，氧化反应进展，没有同样的反应。然后，通过参与每个反应的酶蛋白水平检查了11,20-二羟基固醇和羟基丙糖蛋白的底物特异性。通过在离子交换柱，羟基磷灰石柱和亲和力柱上的各种色谱法纯化酶系统。通过向纯化的氧化酶溶液中添加5 mM底物和10 mM辅酶并在37°C中孵育24小时，进行反应。结果，氧化酶特异性转化为11,20-二羟基固醇，很明显，这些底物中反应器反应性的差异是由于氧化酶的底物特异性引起的。