Gel-phaseNMR法の開発と膜蛋白質への応用

凝胶相核磁共振方法的发展及其在膜蛋白中的应用

• 批准号: 16770116
• 负责人: 児嶋 長次郎
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16770116/
• 关键词: NMR; 樹脂固定化; 相互作用; 立体構造; 膜タンパク質

本研究では溶液NMRを用いたGel-phaseにおける蛋白質の立体構造解析法を確立し、膜蛋白質へ応用することを目指している。具体的には、溶液NMRによるGel-phase蛋白質の構造解析法の開発、可溶性向上を目指した融合蛋白質(可溶化タグ)の選択と溶液条件下における構造解析可能性の検討、無細胞蛋白質合成系を用いた可溶化タグ付加膜蛋白質の大量調製法の検討、界面活性剤共存下でのGel-phase NMRの膜蛋白質への応用を行う。本年度の実施実績は以下の通りである。昨年度に引き続き可溶性向上を目指した融合蛋白質(可溶化タグ)の選択と溶液条件下における構造解析可能性の検討、および、無細胞蛋白質合成系を用いた可溶化タグ付加膜蛋白質の大量調製法の検討を行った。光回避シグナルを伝える古細菌由来2回膜貫通型蛋白質pHtrIIについて加茂直樹教授(北大薬)の協力を得て大腸菌を用いた大量発現系によるNMR試料の調製を、また河野俊之チームリーダー(三菱化学生命研)の協力を得て4種(TRX、GST、GFP、MBP)の可溶化タグ融合蛋白質として小麦胚芽無細胞蛋白質合成系によるpHtrIIの大量調製を行い、溶液中やGel-phaseでの解析に最適なサンプル調製法を検討した。GSTタグは界面活性剤に対して不安定であり、膜蛋白質の構造解析には適していなかった。GFPタグやMBPタグは界面活性剤存在下においても安定であり、溶液中で比較的良好なスペクトルが得られることが分かった。今後はGFPタグやMBPタグを付加した蛋白質を樹脂担体へ安定に固定化する手法の開発を進める。

在本研究中，我们的目标是建立一种利用溶液核磁共振分析凝胶相蛋白质三维结构的方法，并将其应用于膜蛋白。具体来说，我们将开发一种使用溶液NMR的凝胶相蛋白质结构分析方法，选择旨在提高溶解度的融合蛋白（溶解标签）并检查溶液条件下结构分析的可能性，并研究无细胞蛋白质合成系统。研究人员将利用制备可溶性标记膜蛋白的方法研究可溶性标记膜蛋白的大规模制备方法，并在表面活性剂共存下将凝胶相NMR应用于膜蛋白。今年的实施效果如下。继去年以来，我们的目标是选择以提高溶解度为目的的融合蛋白（溶解标签），研究在溶液条件下进行结构分析的可能性，以及使用无细胞蛋白质合成大量制备溶解标签膜蛋白的方法我们已经考虑过了。在 Naoki Kamo 教授（北海道大学制药学院）的合作下，我们利用大肠杆菌的大规模表达系统制备了 NMR 样品，该表达系统来自古细菌，可传递避光信号。化学生命研究所）合作考虑到这一点，我们使用小麦胚芽无细胞蛋白合成系统制备了大量的 pHtrII 作为四种类型（TRX、GST、GFP、MBP）的可溶性标签融合蛋白，使其成为溶液中分析的理想样品或凝胶相的制备方法进行了研究。 GST 标签对去污剂不稳定，不适合膜蛋白的结构分析。结果发现，即使在表面活性剂存在下，GFP标签和MBP标签也很稳定，并且在溶液中可以获得相对较好的光谱。未来，我们将开发将带有 GFP 标签或 MBP 标签的蛋白质稳定固定在树脂载体上的方法。

项目成果

Amino acid residues involved in substrate recognition of the Escherichia coli ORF135 protein

参与大肠杆菌 ORF135 蛋白底物识别的氨基酸残基

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・15
• 作者: Numata;T.;Fukai;S.;Ikeuchi;Y;Suzuki;T.;Nureki;O.;Y.Tanaka;M.Mishima;Y.Tanaka;K.Furuita;Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida
• 通讯作者: Emiko Iida

Functional roles of the metal ion at the A9/G10.1 site in hammerhead ribozymes

锤头核酶 A9/G10.1 位点金属离子的功能作用

• 发表时间: 2004
• 期刊: J.Am.Chem.Soc. 126
• 作者: M.Hoshino;Y.O.Kamatari;S.Ohnishi;et al.(T.R.Obalinsky ed.);鎌足雄司他(桑田一夫編);Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida;Yuki Sudo;Kazuhiko Nakatani;Masaki Mishima;Emiko Kudo;Y.Tanaka
• 通讯作者: Y.Tanaka

Linker region of a Halobacterial transducer protein interacts directly with its sensor retinal protein

盐细菌转导蛋白的连接区与其传感器视网膜蛋白直接相互作用

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・16
• 作者: Numata;T.;Fukai;S.;Ikeuchi;Y;Suzuki;T.;Nureki;O.;Y.Tanaka;M.Mishima;Y.Tanaka;K.Furuita;Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida;Yuki Sudo
• 通讯作者: Yuki Sudo

Disassembling and bleaching of chroride-free pharaonis halorhodopsin by octyl-beta-glucoside

辛基-β-葡萄糖苷对无氯法老尼盐视紫红质的降解和漂白

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・39
• 作者: M.Hoshino;Y.O.Kamatari;S.Ohnishi;et al.(T.R.Obalinsky ed.);鎌足雄司他(桑田一夫編);Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida;Yuki Sudo;Kazuhiko Nakatani;Masaki Mishima;Emiko Kudo
• 通讯作者: Emiko Kudo

Solution structure of the peptidoglycan binding domain of B. subtilis cell wall lyticenzyme CwlC : Characterization of the sporulation-related repeats by NMR

枯草芽孢杆菌细胞壁溶解酶 CwlC 的肽聚糖结合域的溶液结构：通过 NMR 表征孢子形成相关的重复序列

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemistry 44・30
• 作者: Numata;T.;Fukai;S.;Ikeuchi;Y;Suzuki;T.;Nureki;O.;Y.Tanaka;M.Mishima;Y.Tanaka;K.Furuita;Toshitatsu Kobayashi;Emiko Iida;Yuki Sudo;Kazuhiko Nakatani;Masaki Mishima
• 通讯作者: Masaki Mishima