CHPによるNa+/H+交換輸送体NHE1の活性制御機構の解明

CHP 阐明 Na+/H+ 交换转运蛋白 NHE1 活性调节机制

• 批准号: 19036015
• 负责人: 児嶋 長次郎
• 金额: $ 4.03万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19036015/
• 关键词: 構造生物学; NMR; シグナル伝達; タンパク質; 分子認識

Na^+/H^+交換輸送体NHE1はNa^+濃度勾配をエネルギーとしてH^+を排出することで細胞内pHなどの調節を行う。増殖因子や発ガン因子による刺激は最終的にNIIE1を活性化して細胞をアルカリ化させる。この活性化にはNHE1のC末端細胞質ドメインにカルシニューリンB類似蛋白質CHPが結合することが必須であり、CHPは細胞内pHに依存した活性化制御を行うpHセンサーとして機能することが示唆されている。そこで本研究では輸送活性のpH依存性が異常なCHP1変異体を用い、そのpH依存性をNMRと分子動力学計算により解析することでpHセンシング部位の同定を目指した。また、活性型となる酸性条件下での構造解析を試み、活性型と不活性型の構造の違いからpHセンシング部位とpHに依存した活性制御メカニズムの解明を目指した。平成20年度はCHP1/NHE1複合体のpH感受性異常変異体などを用いたNMRによるpHタイトレーション実験を行うために、本研究で開発したpCold-GSTシステムを用いたサンプル調製を行った。今まで分解により発現精製が不可能であったNHE1ペプチドの調製に成功し、そのNMR解析からNHE1ペプチドは単独ではフレキシブルであり、CHP1との結合によりヘリックス構造が誘起されることが明らかになった。一方NHE1はpH依存的な活性制御を受けている。そこでCHP1/NHE1複合体のpH依存性をNMRで解析したところ、pH依存的な立体構造変化が見いだされた。この変化はCHP1とCHP2で電荷が大きく異なるNドメインのNHE1結合面に集中しており、CHPとNHE1との相互作用がpH依存的である可能性を示している。

Na^+/H^+交换转运蛋白NHE1利用Na^+浓度梯度作为能量，通过排泄H^+来调节细胞内pH。生长因子和致癌因子的刺激最终会激活 NIIE1 并使细胞碱化。钙调神经磷酸酶 B 样蛋白 CHP 与 NHE1 C 端胞质结构域的结合对于这种激活至关重要，并且有人认为 CHP 作为 pH 传感器，根据细胞内 pH 值控制激活。因此，在本研究中，我们的目的是通过使用具有异常 pH 依赖性的转运活性的 CHP1 突变体来识别 pH 传感位点，并使用 NMR 和分子动力学计算分析其 pH 依赖性。我们还尝试分析酸性条件下活性形式的结构，旨在根据活性和非活性形式之间的结构差异阐明pH传感位点和pH依赖性活性控制机制。 2008年，我们使用本研究开发的pCold-GST系统制备了样品，以便使用CHP1/NHE1复合物的pH敏感异常突变体通过NMR进行pH滴定实验。我们成功地制备了NHE1肽，该肽此前因降解而无法表达和纯化，其NMR分析表明NHE1肽单独时是柔性的，但当与CHP1结合时，会诱导出螺旋结构。另一方面，NHE1 受到 pH 依赖性活性调节。当我们通过 NMR 分析 CHP1/NHE1 复合物的 pH 依赖性时，我们发现了 pH 依赖性构象变化。这种变化集中在 N 结构域的 NHE1 结合面上，其中 CHP1 和 CHP2 具有显着不同的电荷，表明 CHP 和 NHE1 之间的相互作用可能是 pH 依赖性的。

项目成果

可溶性タンパク質発現に有効な新規大腸菌発現系の構築と応用

一种有效表达可溶性蛋白的新型大肠杆菌表达系统的构建及应用

• 发表时间: 2008
• 作者: Terawaki;S.;多胡 憲治;林こころ
• 通讯作者: 林こころ

Regulation of rice NADPH oxidase by binding of Rac GTPase to its N-terminal extension

• DOI: 10.1105/tpc.107.055624
• 发表时间: 2007-12-01
• 期刊: PLANT CELL
• 影响因子: 11.6
• 作者: Wong, Hann Ling;Pinontoan, Reinhard;Shimamoto, Ko
• 通讯作者: Shimamoto, Ko

基礎から学ぶ構造生物学

从基础开始学习结构生物学

• 发表时间: 2008
• 作者: H.L. Wong;R. Pinontoan;K. Hayashi;R. Tabata;T. Yaeno;K. Hasegawa;C. Kojima;H. Yoshioka;K. Iba;T. Kawasaki;K. Shimamoto;Y. Saito;H. L. Wong;Y.Tanaka;M.Mishima;Y.Tanaka;K.Furuita;児嶋長次郎
• 通讯作者: 児嶋長次郎

Crystallographic characterization of the N-terminal domain of a plant NADPH oxidase

植物 NADPH 氧化酶 N 端结构域的晶体学表征

• 发表时间: 2008
• 期刊: Acta Crystallogr F64
• 作者: Oda;et.al.
• 通讯作者: et.al.

Enzymatic Characterization of 5-Methlthioribose 1-Phosphate Isomerase from Bacillus subtilis

枯草芽孢杆菌 5-甲基硫核糖 1-磷酸异构酶的酶学表征

• 发表时间: 2007
• 期刊: Biosci. Biotectnol. Biochem. 71
• 作者: Tahara;Y.;G. Masunaga;H. Ota.;田原 義太慶;田原義太慶・増永元・太田英利;田原義太慶・増永元・太田英利;太田英利;太田英利・高橋亮雄;太田英利;C. Kojima;Y. Saito
• 通讯作者: Y. Saito