脱ユビキチン化酵素AMSHによる細胞内小胞輸送の制御機構の解析

去泛素化酶AMSH控制细胞内囊泡运输的机制分析

基本信息

批准号：
16770094
负责人：
小嶋克彦
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年、エンドソームの肥大化や細胞膜レセプターの分解阻害を誘導するHrsの過剰発現がSTAMの共発現により解消される一方、AMSHによる同様の効果が見られないことを報告した。STAMはそのCoiled-coilドメインを介してHrsと、SH3ドメインを介してAMSHと結合することから、STAMのドメイン欠損変異体(それぞれSTAM-DCC、STAM-DSH3)それぞれをHrsと共発現したところ、共にエンドソームの肥大化を抑制することはできなかった。このとき、STAM-DCCは細胞質中に拡散していたが、STAM-DSH3は肥大化エンドソーム上でHrsと共存していた。この結果は、Hrs-STAM共発現による肥大化エンドソームの解消にAMSHが必要であることを示唆している。さらにこれを検証するため、Hrs-STAM共発現293T細胞にAMSHの脱ユビキチン化活性欠損点変異体AMSH-D348Aを導入したところ、肥大化エンドソームが観察され、それには3者が共存していた。また、この肥大化エンドソームはクラスリンや後期エンドソーム蛋白質であるLAMP3が局在することから、マルチベシキュラボディ(MVB)の形成が阻害されたものと考えられた。そこで、MVB形成に関与するESCRT-I複合体の構成成分であるTsg101のHrs過剰発現293T及びHeLa細胞での局在を観察したところ、本来HrsによりMVBにリクルートされるべきTsg101は肥大化エンドソームには全く存在しなかった。以上のことから、MVB形成に必須であるESCRT複合体のエンドソームへのリクルートにはHrsのみならずAMSHの脱ユビキチン化活性が関与していることが示唆された。

去年，我们报告说，HRS的过表达（诱导内体肥大并抑制细胞膜受体的降解）通过Stam的共表达解决，而AMSH则没有发现类似的作用。由于Stam通过其盘绕螺旋的结构域和AMSH通过SH3结构域与HRS结合，因此当StAM的域缺陷型突变体（分别stam-DCC和Stam-DSH3）与HRS共表达，这两者都无法抑制内体肥大。目前，Stam-DCCS扩散到细胞质中，而Stam-DSH3与肥厚性内体上的HRS共存。该结果表明，通过HRS-StAM共表达解决肥厚的内体需要AMSH。为了进一步验证这一点，当将AMSH-D348A（AMSH-D348A）（突变突变体去泛素化）引入了共表达293T细胞的HRS-StAM时，观察到了肥厚的内体，其中三个共存。此外，由于网格蛋白和晚期内体蛋白LAMP3位于该肥厚性内体中，因此人们认为抑制了多囊体（MVB）的形成。因此，我们观察到过表达HRS的293T和TSG101的定位，TSG101是参与MVB形成，HRS和HELA细胞中的ESCRT-I复合物的成分。肥厚性内体中不存在最初由HRS招募到MVB的TSG101。从以上，建议不仅HRS，而且AMSH的去泛素化活性都参与了招募ESCRT复合物，这对于MVB形成至关重要。