ヒトREV3タンパク質の大腸菌における発現誘導系の構築と精製法の確立

人REV3蛋白大肠杆菌表达诱导体系的构建及纯化方法

基本信息

批准号：
04J52862
负责人：
朴金蓮
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J52862/
关键词：
REV3遺伝子損傷乗り越えDNA合成 PCRによる塩基置換導入法組み換えREV3タンパク質突然変異遺伝子発現誘導アフィニティークロマトグィ大腸菌のシャペロン遺伝子損傷乗り換えDNA合成 PCRによる塩基置換導入使用頻度の低いコドン使用頻度の高いコドン Hisアフイニテイークロマトグラフイ FLAGアフイニテイークロマトグラフイ

项目摘要

ヒトREV3タンパク質はヒトでの損傷乗り越え(translesion)DNA合成経路の生化学的解析に必要不可欠なタンパク質因子の一つである。本研究では、組み換えREV3タンパク質を大腸菌で効率よく発現誘導させる系を構築し、組み換えREV3タンパク質の精製法を確立することを目的とする。これまでは、REV3遺伝子が350kDaという巨大タンパク質をコードすることから、組み換えタンパク質の発現誘導が難しく研究の防げとなっていた。実際に、ヒトREV3遺伝子を大腸菌で発現させたところ、REV3タンパク質に相当する産物を確認することができなかった。ヒトREV3遺伝子のコドン組成は大腸菌での使用頻度の低いコドンが多く、REV3タンパク質をコードするコドン3133個のうち、大腸菌での使用頻度の低いコドンは763個見出され、これが発現の阻害要因であると考えられた。そこで、PCRによる塩基置換導入法を使って、REV3遺伝子の大腸菌での使用頻度の低いコドン763個のうち、299個のコドンを大腸菌での使用頻度の高いコドンに置換した。改変REV3遺伝子を大腸菌において発現させた結果、コドン改変前には全く発現が観察することができなかった組み換えREV3タンパグ質が、コドン改変後には銀染色で観察することができるレベルまで増加することが分かった。このタンパク質の見かけ上の分子サイズは350KDaにほぼ一致し、またREV3タンパク質の特異的な抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果、組み換えREV3タンパク質の発現が誘導されたことが明らかになった。また、精製をより容易にするために、N-末端にHisタグ、C-末端にFLAGタグを付けた。発現誘導処理した菌体を溶菌し、可溶性画分として回収された大腸菌粗抽出液をFLAG抗体カラムにかけ、FLAGペプチドにより溶出した後、キレーティングセファロース(chelating sepharose)にニッケル(Ni)を結合させたカラムにかけ、イミダゾール(imidazole)の濃度を上げてカラムから溶出した。これにより、組み換えREV3タンパク質の部分精製に成功した。また、大腸菌のシャペロン(trigger factor)遺伝子を導入共発現し精製を試みた。今後は、菌体破砕法の条件を検討し、精製度の高い可溶性組み換えREV3タンパク質を得ることを目指す。

人Rev3蛋白是DNA合成途径生化分析的必要蛋白质因素之一。在这项研究中，目的是建立一个具有大肠杆菌的重组Rev3蛋白的系统，并建立了回收的Rev3蛋白精炼方法。到目前为止，由于Rev3基因编码了350KDA的巨大蛋白质，因此很难诱导重组蛋白的表达并可以预防。实际上，当在大肠杆菌中表达人Rev3基因时，无法确认相当于Rev3蛋白的产物。许多人Rev3基因的密码子组成通常用于大肠杆菌，在3133个密码子编码的Rev3蛋白中，已经在大肠杆菌中使用了763个密码子，这是表达的因素。因此，使用一种通过PCR引入碱基替代的方法，在763个密码子中，在Escherichia Coli的Escherichia Coli中使用了299个密码子在Escherichia大肠杆菌中用高频的密码子代替，在Escherichia Coli的Escherichia Coli中的大肠杆菌中使用了299个密码子。 Rev3基因。由于在密码子修饰之前无法观察到重组Rev3主要的大肠杆菌中的修改后的Rev3基因，因此我知道，我知道，密码子修饰后可以观察到的水平。该蛋白质的表观分子大小几乎与350KDA相同，并且由于使用Rev3蛋白的特异性抗体，蛋白质印迹的结果，诱导了重组Rev3蛋白的表达。为了使纯化更容易，他的标签已连接到n端，并将标志标签附加到c端。已诱导的诱导诱导的细菌施加到FLAG抗菌柱上，并在E. E.细菌粗糙的提取物将可溶性油漆涂在Flag抗体上的E.细菌提取物之后将镍（Ni）粘在裂变的Sepharrose上。列，用标志肽洗脱后，我将其放在柱上，并增加咪唑的浓度并从色谱柱中洗脱。结果，重组Rev3蛋白的部分纯化成功。此外，表达了大肠杆菌的触发因子基因的引入并试图纯化。将来，我们将检查细菌粉碎方法的条件，并旨在获得高度精制的可溶性重组Rev3蛋白。