リポ多糖を認識する蛋白質MD-2およびTLR4受容体のX線結晶構造解析

识别脂多糖的蛋白质 MD-2 和 TLR4 受体的 X 射线晶体结构分析

基本信息

批准号：
04J11715
负责人：
大戸梅治
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

グラム陰性細菌感染症に起因するエンドトキシンショックは生命を脅かす非常に重篤な症状であり,その治療薬の開発が待望されている。この症状を引き起こす原因物質であるリポ多糖を認識して,過剰な免疫応答を惹起する自然免疫系の蛋白質としてMD-2とTLR4受容体が同定されているが,リボ多糖認識およびシグナル伝達の分子機構は明らかになっていない。研究代表者は、MD-2およびTLR4蛋白質がリポ多糖を認識して免疫応答を引き起こす機構を三次元構造から明らかにするため,これらの蛋白質の大量発現系の構築、精製、性状解析、結晶化と結晶構造解析を進めた。酵母で発現させたヒトMD-2を酵素により短鎖化した試料を用い,ネーティブ体と阻害剤lipid IVaとの複合体について正方晶系の同型の結晶を得た。ネーティブ体結晶について重原子同型置換法により,初期位相を決定し三次元構造モデルを構築した。ネーティブ体とlipid IVa複合体について,それぞれ分解能2.0Åと2.2Åまでの反射を用いて構造を精密化した。MD-2は2つの逆平行βシートから成る単一のドメイン構造を有する。2つのβシートの間には体積約1,700Å^3の大きな疎水的なポケットが存在する。このポケット内に,ネーティブ体構造では3分子のミリスチン酸に相当する電子密度が,lipid IVa複合体ではlipid IVaの4本の脂肪酸鎖の電子密度が確認された。Lipid IVaのリン酸基とグルコサミンの部分は,ポケットの入口に存在し,MD-2との間に3本の水素結合を形成する。

由革兰氏阴性细菌感染引起的内毒素休克是一种非常严重且危及生命的病症，人们热切期待治疗药物的开发。 MD-2 和 TLR4 受体已被确定为先天免疫系统的蛋白质，可识别脂多糖（引起这种症状的病原体）并诱导过度的免疫反应，其机制尚不清楚。主要研究者将构建、纯化、表征和结晶MD-2和TLR4蛋白的大规模表达系统，以阐明它们识别脂多糖并从三维结构触发免疫反应的机制并继续进行。具有晶体结构分析。使用在酵母中表达并酶促缩短的人MD-2样品，获得了天然形式的四方同构晶体以及与抑制剂脂质IVa的复合物。采用重原子同构置换法确定了原生晶体的初始相，并构建了三维结构模型。使用分辨率分别高达 2.0 Å 和 2.2 Å 的反射对天然形式和脂质 IVa 复合物的结构进行了精修。 MD-2 具有由两个反向平行 β-折叠组成的单结构域结构。两个 β 折叠之间存在一个体积约为 1,700 Å^3 的大疏水袋。在该口袋内，在天然结构中确认了对应于肉豆蔻酸的三个分子的电子密度，并且在脂质IVa复合物中确认了对应于脂质IVa的四个脂肪酸链的电子密度。脂质IVa的磷酸基团和葡萄糖胺部分存在于口袋的入口处并与MD-2形成三个氢键。