植物の発生、抵抗性反応におけるNMDの機能に関する解析

NMD在植物发育及抗性反应中的作用分析

• 批准号: 04J10986
• 负责人: 堀 孝一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J10986/
• 关键词: Nonsense mediated mRNA decay; 選択的スプライシング; RNA代謝

前年までに行ったNonsense mediated mRNA decay (MD)によって分解されている遺伝子(NMD標的遺伝子)の予測とAtUPF3遺伝子のNMDへの関与の結果をまとめ、Plant Journalへの報告を行った。その結果をふまえNMDに関与することが期待されるAtUPF1,AtUPF2とAtUPF3遺伝子の相互作用の解析を、免疫沈降実験によって行った。その結果大腸菌で発現した部分長AtUPF1とAtUPF2はそれぞれ、植物体で発現したAtUPF3と相互作用していることが確認でき、AtUPF1,AtUPF2,AtUPF3は複合体を形成していることが示唆された。次に、AtUPF3と緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質の細胞内局在を解析した結果、AtUPF3は核小体および細胞質全般と細胞質に顆粒状の構造として局在していることを明らかにした。さらに3種類のAtUPF3の部分欠失体を作成し、同様に細胞内局在の解析を行った結果、AtUPF3のC末端側2/3が核小体への局在に強く関連していることを示した。またAtUPF3として機能しないことが予測される部分欠失体では全て細胞質の顆粒状の局在が観察されなかったことから、この細胞質における顆粒状構造はNMDにおいて重要な働きをしていることが示唆された。この顆粒状構造はサイクロヘキシミドによってタンパク質翻訳を停止しNMDを阻害すると、すみやかに消失することを発見した。よってこの顆粒状構造はNMDにおけるRNA分解の場であることが期待される。

我们总结了前一年对无义介导的mRNA衰减（MD）降解的基因（NMD靶基因）以及AtUPF3基因参与NMD的预测结果，并在《Plant Journal》上报道。基于该结果，我们通过免疫沉淀实验分析了AtUPF1、AtUPF2和AtUPF3基因之间的相互作用，这些基因预计与NMD有关。结果，证实了在大肠杆菌中表达的部分长度AtUPF1和AtUPF2各自与在植物中表达的AtUPF3相互作用，表明AtUPF1、AtUPF2和AtUPF3形成复合物。接下来，我们分析了AtUPF3和绿色荧光蛋白融合蛋白的细胞内定位，发现AtUPF3一般定位于核仁，细胞质，细胞质呈颗粒状结构。此外，我们创建了 AtUPF3 的三种部分缺失形式，并类似地分析了它们的细胞内定位，结果发现 AtUPF3 的 C 端三分之二与核仁定位密切相关。此外，在预测不发挥AtUPF3功能的所有部分缺失突变体中均未观察到细胞质中的颗粒状定位，这表明细胞质中的这种颗粒状结构在NMD中发挥着重要作用。他们发现，当放线菌酮停止蛋白质翻译并抑制 NMD 时，这种颗粒结构很快消失。因此，这种颗粒结构预计是 NMD 中 RNA 降解的位点。