RANKL刺激で出現する核内構造体におけるRNA制御を介した骨代謝制御機構の解明

阐明 RANKL 刺激后出现的核结构中 RNA 调节介导的骨代谢控制机制

• 批准号: 22KJ2800
• 负责人: 荒崎 恭弘
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tokyo University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2800/
• 关键词: 破骨細胞; RNA結合タンパク質; 転写後調節; 骨代謝; mRNA安定性; 核内構造体; 選択的スプライシング

Cpeb4はCPE配列を含むmRNAに結合する因子であり，転写後調節を介して，がん系統分化や赤血球終末分化を制御する。以前，私は，Cpeb4が破骨細胞分化を促進する因子であることを報告したが，Cpeb4の詳細な分化メカニズムや標的遺伝子は不明であった。そこで，Cpeb4抑制時に遺伝子発現が減少した，破骨細胞マスター転写因子であるNfatc1に着目し，Cpeb4による転写後調節を検討した。shRNAによりCpeb4を抑制したRAW264.7株を用いて，RNA-seq解析およびqPCRを行った結果，未分化状態にも関わらず，破骨細胞分化遺伝子が有意に減少した。またRANKL刺激によるRANKL下流シグナル（p-Akt, p-IkB, p-JNK, p-p38）の活性が減少した。さらに，細胞増殖が促進していることが明らかになった。Nfatc1 mRNAおよびタンパク質量は，Cpeb4抑制により減少した。次に，Cpeb4がNfatc1の転写後調節を制御するかを検討した。転写阻害剤DRB処理後に残存するNfatc1 mRNA量をqPCRで検討したところ，Cpeb4抑制により安定性が減少した。しかしながら，Nfatc1の3’UTRをクローニングし，luciferase assayを行った結果，有意な差は見られなかった。そこで，Nfatc1の転写に着目し，Nfatc1の2種類のプロモーターP1およびP2の活性を検討するために，luciferase assayを行った。その結果，Cpeb4抑制により，P1活性が減少した。また，Cpeb4抑制によってP1領域におけるH3K4me3化の減少，H3K27me3化の増加が見られ，Nftac1転写が強力に抑制された。以上から，Cpeb4はNfatc1 mRNAの安定性を増加し，また転写を間接的に促進することで破骨細胞分化を促進することが示唆された。

Cpeb4是与含有CPE序列的mRNA结合的因子，通过转录后调节控制癌谱系分化和红系细胞的终末分化。之前报道过Cpeb4是促进破骨细胞分化的因子，但Cpeb4的详细分化机制和靶基因尚不清楚。因此，我们将重点放在破骨细胞主转录因子Nfatc1上，当Cpeb4被抑制时，其基因表达降低，并研究了Cpeb4对其的转录后调控。使用RAW264.7菌株进行RNA-seq分析和qPCR，其中Cpeb4被shRNA抑制，尽管处于未分化状态，破骨细胞分化基因却显着减少。此外，RANKL 刺激降低了 RANKL 下游信号（p-Akt、p-IkB、p-JNK、p-p38）的活性。此外，还发现细胞增殖得到促进。 Cpeb4 抑制可降低 Nfatc1 mRNA 和蛋白水平。接下来，我们研究了 Cpeb4 是否控制 Nfatc1 的转录后调控。当我们使用 qPCR 检查转录抑制剂 DRB 处理后剩余的 Nfatc1 mRNA 量时，我们发现由于 Cpeb4 抑制而导致稳定性下降。然而，当我们克隆Nfatc1的3'UTR并进行荧光素酶检测时，没有发现显着差异。因此，我们重点关注 Nfatc1 的转录，并进行荧光素酶测定来检查两个 Nfatc1 启动子 P1 和 P2 的活性。结果，P1 活性因 Cpeb4 抑制而降低。此外，抑制 Cpeb4 会减少 P1 区域 H3K4me3 的形成并增加 H3K27me3 的形成，并强烈抑制 Nftac1 转录。这些结果表明，Cpeb4 增加了 Nfatc1 mRNA 的稳定性，并通过间接促进转录来促进破骨细胞分化。

项目成果

東京理科大学薬学部分子薬理学研究室

东京理科大学药学院分子药理学实验室

Precision Medicine

• DOI: 10.1007/978-1-0716-0904-0
• 发表时间: 2019-05
• 期刊: Precision Medicine
• 作者: Yingping Cao;Xianjin Zhu

破骨細胞分化におけるCpeb4標的遺伝子の網羅的探索

全面寻找破骨细胞分化中的Cpeb4靶基因

• 发表时间: 2021
• 作者: Hashimoto Takeshi;Tsukamoto Hayato;Ando Soichi;Ogoh Shigehiko;李 政道，秋谷 拓郎，荒崎 恭弘，早田 匡芳
• 通讯作者: 李 政道，秋谷 拓郎，荒崎 恭弘，早田 匡芳

RNA結合タンパク質は破骨細胞分化過程において核内局在する

RNA结合蛋白在破骨细胞分化过程中定位于细胞核中

• 发表时间: 2021
• 作者: Satoshi Yoshida; Akihito Soeda; Mio Murao;梅田涼平，清水誠之，波田一誠，寺西仁志，鹿野健史朗，比嘉涼子，漆畑博太郎，白石裕士，花田俊勝，花田礼子;荒崎 恭弘，李 政道，早田 匡芳
• 通讯作者: 荒崎 恭弘，李 政道，早田 匡芳

RNA結合タンパク質Cpeb4 は，Nfatc1の発現を促進することで，破骨細胞分化を促進する

RNA结合蛋白Cpeb4通过促进Nfatc1表达促进破骨细胞分化

• 发表时间: 2022
• 作者: Chihiro BABA;Natsumi TOKUMITSU;Noya LOEW;Hikari WATANABE;Isao SHITANDA;Seiya TSUJIMURA;Masayuki ITAGAKI;瀬川博子;荒崎 恭弘，李 政道，早田 匡芳
• 通讯作者: 荒崎 恭弘，李 政道，早田 匡芳