カルシウムによる転写調節-DREAMの作用-

钙的转录调节 - DREAM 的影响 -

基本信息

批准号：
15791063
负责人：
松田美穂
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15791063/
关键词：
カルシウム転写因子 DREAM 遺伝子発現調節

项目摘要

ヒト甲状腺髄様癌由来細胞株(TT)において、アンチセンスDREAMの導入によりCa^<2+>濃度上昇によってカルシトニン(CT)の発現と分泌が増加したなど、平成15年度の成果より、DREAMのCT分泌調節への関与は確実であると考えられ、さらにその発現調節にも働いている可能性が示唆されたので、平成16年度は主に転写因子DREAMを介するCT遺伝子発現制御機構の解析を行った。CT遺伝子の転写開始点付近から上流の様々な長さの領域を、レポーター(ルシフェラーゼ)遺伝子の上流に組み込んだコンストラクトを作り、DREAMを発現しているTT細胞や、DREAMを発現していないHeLa、HEK293等の培養細胞に形質導入してルシフェラーゼアッセイを行い、Ca^<2+>濃度依存的な転写活性化に必須の領域を検討した。その結果、DRE様配列を含む上流450bp付近の領域が、その特異的な発現調節に関わっていることが分かった。TT細胞では、Ca^<2+>濃度上昇によりプロモータ活性が上昇したが、DREAMを発現していないHeLa細胞では、その変化が見られなかった。そこで、ゲルシフトアッセイを行ったところ、上流450bp付近のDRE様配列にDREAMが結合することが確認された。その他、DRE様配列を含むイントロン1,5についてもコンストラクトを作製し転写活性を検討したが、特に顕著な変化を与える領域は存在しなかった。また、遺伝子導入した細胞にprotein kinase A(PKA)を活性化するforskolin刺激を与えると、Ca^<2+>濃度変化による転写活性の上昇を上回る活性化が見られたので、PKAを介した情報伝達経路の下流に位置するCREBやCREMを介した転写制御もまたCT遺伝子の発現調節に関与していると考えられ、Ca^<2+>を介したシグナリングとのバランスでその遺伝子発現が調節されている可能性が示唆された。

基于2003年获得的结果，反义DREAM的引入由于人甲状腺髓样癌衍生细胞系(TT)中Ca 2+ 浓度的增加而增加了降钙素(CT)的表达和分泌。相信CT肯定参与了CT分泌的调控，并且有人提出，它可能也参与了其表达的调控。2004财年，我们主要分析了CT介导的CT基因表达的控制机制。转录因子梦想去了。我们创建了将 CT 基因转录起始位点上游不同长度的区域插入报告基因（荧光素酶）基因上游的构建体，并使用它们生成表达 DREAM 的 TT 细胞、不表达 DREAM 的 HeLa 细胞、荧光素酶测定通过转导HEK293等培养细胞来进行，并研究了Ca 2+ 浓度依赖性转录激活的必需区域。结果发现上游约450bp的区域含有DRE样序列，参与了特异性表达调控。在TT细胞中，启动子活性随着Ca 2+ 浓度的增加而增加，但在不表达DREAM的HeLa细胞中没有观察到这种变化。因此，当进行凝胶位移测定时，证实DREAM与上游450bp左右的DRE样序列结合。还为内含子 1 和 5 创建了构建体，其中包含 DRE 样序列，并检查了转录活性，但没有区域显示出特别显着的变化。此外，将蛋白激酶添加到转染的细胞中。当我们施加激活A(PKA)的毛喉素刺激时，观察到激活超过了由Ca 2+ 浓度变化引起的转录活性的增加。据认为CREM介导的转录控制也参与了该过程。 CT基因表达的调节，表明基因表达可能与Ca 2+ 介导的信号传导保持平衡。