歯周病関連菌のフォンヴィレブランド因子typeAドメイン類似蛋白質の機能解析

牙周病相关细菌中冯维勒布兰德因子A型结构域蛋白的功能分析

• 批准号: 15791045
• 负责人: 内藤 真理子
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15791045/
• 关键词: フォンウィルブラウン因子; Porphyromonas gingivalis; 歯周病関連菌; フォンウィブラウン因子

歯周病関連菌であるPorphyromonas gingivalis(以下P.gingivalis)の染色体中にヒトの血中にある蛋白質の一つで、血小板凝固反応に必須なフォンウィレブラウン因子のタイプAドメイン(vWFA)に予測構造が相似な、von Willebrand Factor Type A domain protein (PgvWFA)と名付けられた遺伝子のmRNAが発現していること昨年確認した。本年度はこのPgvWFAの発現蛋白質の確認と局在を調べる為、PgvWFAの破壊株を作成した。P.gingivalis ATCC 33277(33277株)のPgvWFA遺伝子の5'末端部位にエリスロマイシン耐性遺伝子を相同組み換えにより挿入し、PgvWFAの欠損株を作成した。PgvWFAの欠損はサザンハイブリダイゼーチョンとRT-PCRにて確認した。またPgvWFAのvWFA領域の遺伝子断片をpGEXベクターに挿入し、大腸菌に形質転換しGST-vWFA融合蛋白質を発現、精製した。GST-vWFA融合蛋白質をFCAと混和後ウサギに免疫した。追加免疫後、採血して抗PgvWFA血清を得た。33277株とPgvWFA欠損株の細胞破砕液をSDS-PAGEに展開し、抗PgvWFA血清にてimmunoblottをおこなった。Whole cell lysate, membrane,分泌画分とも調べたが、結果は抗PgvWFA血清に反応するPgvWFA欠損株で欠落する特異的な蛋白質を検出する事は出来なかった。W83株ではPgvWFA遺伝子の隣にはvWFAへ領域を欠落したPgvWFA類似遺伝子が存在する。が、現在進行中の33277株のゲノム解析の結果ではPgvWFAの遺伝子は99%保存されているが、PgvWFA類似遺伝子は欠落している。この事からvWFA領域を保持することはP.gingivalisにとって意義があり、本年の研究で作製した変異株は今後のPgvWFAの研究に大いに役立つと考えられる。

预测是在牙周病相关细菌牙龈卟啉单胞菌 (P. gingivalis) 染色体中冯威勒布朗因子 (von Wille-Brown Factor) 的 A 型结构域 (vWFA) 中发现的，冯威勒布朗因子是人类血液中发现的一种蛋白质，对于血小板凝固至关重要。去年，我们证实了一种名为冯维勒布兰德因子 A 型结构域蛋白 (PgvWFA) 的基因的 mRNA 表达，该蛋白具有相似的结构。今年，我们创建了 PgvWFA 的破坏菌株，以确认 PgvWFA 的表达蛋白并研究其定位。通过同源重组将红霉素抗性基因插入牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277(菌株33277)的PgvWFA基因的5'端，以产生PgvWFA缺陷菌株。通过Southern杂交和RT-PCR证实PgvWFA的缺失。另外，将PgvWFA的vWFA区域的基因片段插入pGEX载体，转化大肠杆菌表达并纯化GST-vWFA融合蛋白。将 GST-vWFA 融合蛋白与 FCA 混合后对兔子进行免疫。加强免疫后，收集血液以获得抗PgvWFA血清。来自 33277 菌株和 PgvWFA 缺陷菌株的细胞裂解物在 SDS-PAGE 上显色，并用抗 PgvWFA 血清进行免疫印迹。还检查了全细胞裂解物、膜和分泌级分，但我们无法检测到 PgvWFA 缺陷菌株中缺失的与抗 PgvWFA 血清反应的特定蛋白质。在W83菌株中，有一个PgvWFA样基因，该基因缺少PgvWFA基因旁边的vWFA区域。然而，正在进行的菌株33277基因组分析结果显示，99%的PgvWFA基因是保守的，但PgvWFA样基因缺失。由此看来，保留vWFA区域对于牙龈卟啉单胞菌具有重要意义，今年研究中创建的突变菌株被认为在未来的PgvWFA研究中有很大的用途。