嫌気性菌ベクターを用いた血管新生抑制物質による肝細胞癌の新しい遺伝子治療の試み

利用厌氧细菌载体的血管生成抑制剂进行肝细胞癌基因治疗的新尝试

基本信息

批准号：
15790373
负责人：
松垣諭
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790373/
关键词：
嫌気性菌血管新生抑制遺伝子導入肝癌

项目摘要

平成15年度の検討において血管新生物質である、エンドスタチンのcDNAを嫌気性菌であるBifidobacterium longumの発現ベクターであるpBR322に組み込んでエンドスタチシ蛋白の発現を検討したが、Bifidobacterium longumはエンドスダチン蛋白を産生することはできても、それを菌体外に分泌することはできないことが明らかとなった。この結果をうけ、平成16年度は、乳酸菌(ラクトバチルスデルブリュッキ)で菌体外に産生蛋白を分泌させることが可能なベクターであるpSECE1を明治乳業から譲り受け、このベクターにpProEXHTベクターに組み込まれていた新たな血管新生抑制物質であるヒトKringlel-5のcDNAをを制限酵素にて切り出し、組み込んだ。次に、ヒトKringle1-5のcDNAを組み込んだpSECE1ベクターをエレクトロポレーション法にてラクトバチルスデルブリュッキに遺伝子導入し、アネロパックで嫌気性下に培養した。さらに、ラクトバチルスデルブリュキをLysis B bufferにメルカプトエタノールとウレアを加えた溶液を作成し、これをラクトバチルスデルブリッキに加えたのちにボルテックスで溶菌させ、菌体の蛋白を採取した。この蛋白と培養液を共にウエスタンブロッティングを行いヒトKringle1-5蛋白の産生を確認した。つぎに、ヒトKringle1-5のcDNAをを組み込んだラクトバチルスデルブリュッキを培養した培養液からHis-tag catcherを用いて抽出したHis-tagをラベルしたヒトKringle1-5蛋白をウシ毛細血管内皮細胞の培養液中に添加し、生細胞数測定試薬SFを用い、呈色反応をマイクロプレートリーダーにて測定し、細胞増殖能を対照群と比較した。その結果、内皮細胞の増殖はヒトKringle1-5蛋白により約35%抑制された。この結果を受け、平成17年度ではヌードマウスに肝癌細胞株を接種したモデルにたいしヒトKringle1-5のcDNAを組み込んだラクトバチルスデルブリュッキを投与し抗腫瘍効果を検討する予定である。

在2003年的一项研究中，将血管生成物质的cDNA掺入了PBR322中，PBR322是厌氧菌细菌的表达载体，双歧杆菌长杆菌，以检查内抑素蛋白的表达。据揭示，双歧杆菌长杆可以产生内核蛋白，但不能外部分泌。基于这些结果，在2004年，PSECE1是一种能够分泌乳酸细菌（Meiji乳制品行业）中乳酸细菌（Lactobacillusdelbrücki）的蛋白质，人类Kringlel-5的cDNA，一种新的血管生成抑制剂的cDNA，将其纳入载体中，并融合到了载体中。接下来，将掺入人类kringle1-5 cDNA的PSECE1载体通过电穿孔转移到乳杆菌中，并使用Aneropac在厌氧条件下培养。此外，制备了一种溶液，其中将墨塔乙醇和尿素添加到裂解B缓冲液中，然后将其添加到Delbrick乳酸杆菌中，该乳脂杆菌是通过涡旋形成的，以从细菌中收集蛋白质。该蛋白质和培养基都均为蛋白质，以确认人类Kringle1-5蛋白的产生。接下来，使用培养基中的HIS-tag捕捉器提取的HIS-TAG标记的人类Kringle1-5蛋白在该培养基中添加了乳酸杆菌luck，在该培养基中添加了乳酸乳杆菌，将乳酸乳杆菌纳入了人类Kringle1-5 cDNA中，将牛毛细血管内皮细胞的培养基添加到培养基中，并使用微细胞填充物进行了测量的实时计数，并使用微孔读取物进行了颜色反应，并将其与实时的计数进行测量。结果，人类Kringle1-5蛋白抑制了内皮细胞的增殖。为了响应这些结果，我们计划管理将人类kringle1-5的cDNA的乳杆菌delbrucchi纳入裸鼠中与肝癌细胞系接种的模型，以研究抗肿瘤效应。