Msi-1過剰発現モデル作成およびそれを用いた肝再生促進機構の解明

Msi-1过表达模型的建立及利用其阐明肝再生促进机制

基本信息

批准号：
15790334
负责人：
伊藤純一
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790334/
关键词：
musashi 肝再生トランスフェクショントランスジェニックマウス Msi-1

项目摘要

本研究は幹細胞のマーカーとして新たに着目されたMsi-1の肝再生に関わる機能および個々の因子への作用を明らかにすることを目的とする。平成16年度報告書に記載した、再度行われたHepG2細胞へのMsi-1実験は今年度に引継ぎ行われ多数のクローンが作成された。以上より前年度までの研究と合わせ、結果として2種類のプロモーター(サイトメガロウイルスプロモーターおよびserumamyloid P componentプロモーター)をそれぞれ持つ2種類のMsi-1遺伝子は、それぞれラット初代培養肝細胞とHepG2細胞に導入された。1.ラット初代培養肝細胞に対するMsi-1過剰発現。2種類のプロモーターをそれぞれ持つコンストラクトのいずれを導入した場合においても、導入肝細胞は、コントロールに比べ増殖率、経時的減少細胞数に有意な差が認められなかった。また形態的に変化を認めなかった。2.HepG2細胞に対するMsi-1遺伝子の一過性発現導入。ヒト肝癌細胞株であるHepG2細胞では、Msi-1の一過性発現によって明らかな形態的変化を認めなかった。HepG2細胞の増殖率はもともと非常に高く、Msi-1の一過性発現による増殖率変化の検討は困難であった。3.安定細胞株の解析。ベクター内在の薬剤耐性遺伝子を利用したG418による選択的な培養で得られた細胞は、継代されたが、形態的変化を認めず、またウエスタンブロット法で継代された導入HepG2細胞ではMSI蛋白の発現が非常に弱いことが確認された。以上の結果より、HBXプロモーターなどの強力なプロモーターを用いて過剰発現をされることや、またより効率のよいアデノウイルス等を用いた持続感染による過剰発現の手法を用いてMsi-1を十分に発現させる必要性が示唆された。コンストラクト作成時に明らかになったalternate exonについては、欠失部位の補正を行いその存在意義について解析する予定である。

本研究的目的是阐明近年来作为干细胞标记物而受到关注的Msi-1的功能及其对肝再生相关个体因素的影响。 2004年报告中描述的对HepG2细胞的重复Msi-1实验今年继续进行，并创建了许多克隆。基于去年进行的研究，将两种Msi-1基因分别导入大鼠原代培养肝细胞和HepG2细胞中，每种基因均具有两种类型的启动子（巨细胞病毒启动子和血清淀粉样蛋白P成分启动子）。完毕。 1. Msi-1在大鼠原代培养肝细胞中过度表达。当导入具有两种类型的启动子的构建体中的任一种时，与对照相比，在转染的肝细胞中随时间推移的增殖率或细胞数量的减少没有观察到显着差异。此外，没有观察到形态学上的变化。 2.将Msi-1基因瞬时表达导入HepG2细胞中。在人肝癌细胞系 HepG2 细胞中，由于 Msi-1 的瞬时表达，没有观察到明显的形态变化。 HepG2细胞的增殖率本来就很高，由于Msi-1的瞬时表达，很难检查增殖率的变化。 3.稳定细胞系分析。利用载体内部耐药基因与G418选择性培养获得的细胞进行传代，但没有观察到形态变化，并且Western blotting证实传代的转染HepG2细胞中未观察到MSI蛋白的表达非常弱。。基于上述结果，Msi-1可以通过使用强启动子如HBX启动子的过表达，或者通过使用腺病毒等通过持续感染的更有效的过表达方法来充分表达。提出了表达的必要性。对于构建体创建过程中发现的替代外显子，我们计划纠正删除位点并分析其存在的意义。