膜貫通ペプチドを用いた膜融合型磁性担体へのタンパク質アセンブリング技術の開発

利用跨膜肽在膜融合磁性载体上开发蛋白质组装技术

基本信息

批准号：
15760583
负责人：
田中剛
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

平成16年度の研究成果を以下に概説する。本研究は有機薄膜融合型ナノ磁性粒子を調製し、その薄膜上に効率的に挿入される膜貫通ペプチドをスクリーニングし、ナノ磁性粒子上へのタンパク質のアセンブリング技術を開発することを目的とした。膜融合型磁気微粒子を用い、膜貫通ペプチドのスクリーニングを行った結果、抗菌性ペプチド・temporin L(TL)が選定された。TLは主に原核細菌に対する抗菌性を示し、グラム陰性菌・グラム陽性菌の細胞膜に挿入され、細胞死を誘導すると考えられている。TLの膜融合型磁気微粒子への結合は、反応緩衝液・洗浄緩衝液の塩濃度,pHに影響を受けないことがあきらかとなった。次に、TLをナノ磁性粒子に生体分子をアセンブリングするための分子アンカーとして機能するか評価した。具体的にはビオチン標識したTLを合成し、アビジン-ビオチン結合を利用したストレプトアビジンの膜融合型磁性粒子上への結合を確認した。ここで、TLの膜内での配向性を評価するために、TLのN末端、もしくはC末端にビオチンを標識し、蛍光標識したストレプトアビジンの結合の有無を蛍光顕微鏡観察により確認することとした。その結果、TLのN末端にビオチンを標識したものについてのみストレプトアビジンの結合に由来する蛍光が認められた。このことからTLのC末端側が膜内に挿入され、N末端側が膜上に遊離していることが示されるとともに、生体分子が結合した後においてもペプチドがアンカー分子として膜内に留まっていることが確認された。膜融合型磁性粒子表面のストレプトアビジンの結合数を蛍光強度から算出し、化学架橋法によるストレプトアビジン固定化数と比較した。その結果、TLを用いた場合の結合数は化学架橋法と同レベルであった。本ペプチドアンカーを川いることで生体分子を活性保持したまま膜上にアセンブリングできることが示された。

下面概述了2004年的研究结果。这项研究是准备有机薄膜融合型纳米磁性颗粒，筛选有效插入薄膜的膜肽，并在纳米磁颗粒上开发蛋白质的组装技术。由于使用膜融合型磁性颗粒筛选膜穿透肽的结果，选择了抗菌肽临时L（TL）。据认为，TL主要表明对初期细菌的抗菌，将其插入革兰氏阴性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞膜中，从而诱导细胞死亡。显然，与TL膜融合型磁性细颗粒的结合不受反应缓冲液和清洁缓冲液的盐浓度和pH的影响。接下来，评估了TL作为将生物分子聚集到纳米磁性颗粒中的分子锚的作用。具体而言，合成了生物素签名的TL，并在薄膜融合型瓷器颗粒上证实了使用Avidin-Biotin键的链球菌ABIDINE的结合。在这里，为了评估TL在膜中的方向，生物素在TL的N末端或C末端进行了签名，并通过荧光显微镜证实了荧光分配的链球菌abidine的存在或不存在。。结果，仅针对TL的n端处的生物素标志的人，源自链球菌阿比丁的结合。这表明TL C末端侧插入膜上，并且在膜上分离N末端，即使在生物分子键合之后，肽仍留在膜上作为锚固分子。根据荧光强度计算了链球菌在膜融合型粒子表面上的结合数，并与《化学桥法》与链球菌固定的数量进行了比较。结果，使用TL时的键与化学桥法的水平相同。结果表明，肽锚可以通过握住河流来握住河流的同时将肽锚组装在膜上。