磁気ビーズを利用した膜活性ペプチドの二次構造網羅的解析技術の開発

开发利用磁珠的膜活性肽综合二级结构分析技术

基本信息

批准号：
17686073
负责人：
田中剛
金额：
$ 17.72万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

5残基〜20残までのペプチドライブリーから各種質膜との相互作用が認められるペプチドを網羅的にスクリーニングし、配列、疎水性度、電荷、水溶液/膜中での二次構造を決定したデータベースを構築した。これらを基にH17年度にはペプチドの真正細菌膜、真菌・真核細胞膜、及び核膜に対する生物活性を評価し、大腸菌、枯草菌、真菌(酵母)に対して抗菌活性を示すことを明かとした。さらに、H18年度においてホスファチジルエタノールアミン(PE)で被覆した磁気ビーズを用いて取得した抗菌活性ペプチドについてはSPR解析によりルホスファチジルセリンやホスファチジルコリンと比較してPEに対して選択的に結合することが示された。抗菌活性ペプチドの作用機序は静電的な膜への結合と疎水相互作用に基づく細胞膜への挿入に由来することが考えられ、抗菌活性ペプチド・性状は塩基性且つ親水性の両親媒性を特徴としたものに限られていた。このようなペプチド性状の偏りはペプチドのスクリーニング条件によるバイアスによることが考えられた。そこでより網羅的な膜活性ペプチドの取得を目的として、膜への結合性だけではなく、膜からの脱離を特徴とするペプチドのスクリーニングを行った。中性pH、25℃において膜へ結合したペプチドに対して、加温(37℃)、アルカリ添加(弱アルカリ性)、またはグリセロール添加などの穏和な条件変化によって膜から脱離するペプチドの探索を行った。その結果、25℃においてはPEを主成分とするリン脂質二重膜に強固に結合しているが、37℃において効率的に膜から脱離する脱離ペプチドが見いだされた。これらの挙動は熱揺らぎに伴うペプチドの膜界面での構造変化に由来するものであると考えられた。膜への結合性と脱離能を併せ持つ脱離ペプチドを取得したことで、環境微生物の濃縮や検出への応用が考えられる。具体的にはペプチドを固相化した磁気ビーズで環境微生物を磁気濃縮するとともに、加温(37℃)することにより、磁気ビーズ表面から微生物を効率的に脱離するが可能になると考えられ、環境中からの微生物濃縮及び検出が実現できると期待される。

我们从5到20个残基的肽库中全面筛选了与各种质膜相互作用的肽，并确定了它们的序列、疏水性、电荷和在水溶液/膜中的二级结构，并构建了数据库。基于这些结果，我们在2017财年评估了该肽对真细菌膜、真菌/真核细胞膜和核膜的生物活性，结果表明它对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和真菌（酵母）具有抗菌活性。。此外，SPR分析表明，与磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱相比，2008年度使用磷脂酰乙醇胺(PE)包被的磁珠获得的抗菌活性肽选择性地与PE结合。抗菌肽的作用机制被认为源自与膜的静电结合并基于疏水性相互作用插入细胞膜，但其特征有限。人们认为肽性质的这种偏差是由于肽筛选条件造成的偏差造成的。因此，为了获得更全面的膜活性肽列表，我们筛选了不仅具有与膜结合的特征而且还具有与膜分离的特征的肽。对于在中性 pH 和 25°C 下与膜结合的肽，我们寻找通过加热 (37°C)、添加碱（弱碱性）或添加甘油等条件的轻微变化而从膜上分离的肽。。结果发现，分离肽在25℃下与主要由PE组成的磷脂双层膜牢固结合，但在37℃下有效地从膜上分离。这些行为被认为是由于热波动导致膜界面处肽的结构变化所致。通过获得同时具有膜结合和解吸能力的解吸肽，可以将其应用于环境微生物的浓缩和检测。具体而言，认为通过使用固定有肽的磁珠并加热(37℃)来磁力浓缩环境微生物，可以有效地将微生物从磁珠表面分离，从而可以进行浓缩和检测。来自环境的微生物。