ゼブラフィッシュ小脳プルキンエ細胞活動観察系の確立

斑马鱼小脑浦肯野细胞活性观察系统的建立

基本信息

批准号：
14780612
负责人：
佐々貴之
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780612/
关键词：
ゼブラフィッシュ小脳プルキンエ細胞後脳 zic1 GAD 顆粒細胞 GFP

项目摘要

小脳プルキンエ細胞での発現を規定する転写制御領域を探索した。前年度は、IP3R1あるいはGAD67遺伝子のゲノム領域約100kbではプルキンエ細胞での発現を誘導できないことを明らかにした。今年度は約170kbのGAD65遺伝子領域を含むBACを単離し、転写活性化能を持つGAL4VP16遺伝子及びレポーターUAS : DsRed2をGAD65遺伝子5'UTRに挿入した。これを受精卵に顕微注入しDsRed2の発現を蛍光観察した。DsRed2は脊髄から前脳にかけて神経管の主として腹側領域に発現し、GAD65 mRNAの発現領域との重なりが示唆された。単一細胞レベルで調べる為にはゼブラフィッシュGADを認識する抗体が必要であるが、試みた抗体は特異的なシグナルを出さなかった。抗体探索の継続が必要。背側領域においては小脳にDsRed2の発現が観察された。IP3R1抗体で凍結切片を免疫染色し共焦点蛍光顕微鏡で観察した結果、プルキンエ細胞ではなく隣接細胞であることが明らかになった。この細胞は抑制性の介在神経細胞あるいはグリア細胞の可能性がある。前年度に作製したzic1トランスジェニック(Tg)フィッシュの解析を行った。GFPは小脳で散在的に観察され、顆粒細胞のごく一部に発現していることが示唆された。小脳における発現は個体差が大きかった。一方、小脳以外の後脳では背側の交連性神経細胞に安定してGFPが発現した。軸索は正中を超えた後、吻側へ鋭角に曲がり中脳腹側に終止した。この繊維束および投射領域は成魚における外側縦束および半円隆起に相当すると考えられ、側線および聴覚系の中枢伝達回路を可視化していることが示唆された。神経活動依存的にシグナルを変化させるGFP誘導体をUAS下流に結合したUAS : cameleonおよびUAS : G-CaMPのTgフィッシュとの交配により、神経活動の観察が可能になった。

我们寻找调节小脑浦肯野细胞表达的转录调控区。去年，我们发现浦肯野细胞中约 100 kb 的 IP3R1 或 GAD67 基因基因组区域无法诱导表达。今年，我们分离出了含有约170kb GAD65基因区域的BAC，并将具有转录激活能力的GAL4VP16基因和报告分子UAS：DsRed2插入到GAD65基因的5'UTR中。将其显微注射到受精卵中，并使用荧光观察 DsRed2 的表达。 DsRed2 主要在从脊髓到前脑的神经管腹侧区域表达，表明与 GAD65 mRNA 表达的区域重叠。在单细胞水平上进行研究需要识别斑马鱼 GAD 的抗体，但我们尝试的抗体没有给出特定信号。继续进行抗体搜索是必要的。在背侧区域，在小脑中观察到 DsRed2 表达。用IP3R1抗体对冰冻切片进行免疫染色并在共聚焦荧光显微镜下观察发现细胞不是浦肯野细胞而是邻近细胞。这些细胞可以是抑制性中间神经元或神经胶质细胞。我们分析了去年生产的 zic1 转基因 (Tg) 鱼。观察到 GFP 分散在小脑中，表明它在一小部分颗粒细胞中表达。小脑的表达存在很大的个体差异。另一方面，在小脑以外的后脑中，GFP在背连合神经元中稳定表达。穿过中线后，轴突急剧转向，终止于中脑腹侧。这些纤维束和投影区域被认为对应于成鱼的侧向纵束和半圆形脊，这表明它们可视化听觉系统的侧线和中央传输回路。通过将 UAS：cameleon 和 UAS：G-CaMP 与 Tg 鱼杂交，Tg 鱼具有连接到 UAS 下游的 GFP 衍生物，以神经元活动依赖性方式改变信号，从而可以观察神经元活动。