RBタンパク質の部位特異的リン酸化および分解による標的遺伝子の選択的発現制御機構

RB蛋白定点磷酸化和降解选择性表达控制靶基因机制

基本信息

批准号：
14770044
负责人：
内田千晴
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

[研究目的]重要な癌抑制遺伝子産物のひとつであるRB蛋白質の活性は、主にリン酸化修飾によって制御を受ける。しかしこれまではRB蛋白質の量的制御機構についてはほとんど明らかではなかった。本研究では、RBタンパク質のリン酸化による活性制御および、細胞内での分解機構を明らかにし、細胞悪性化への関わりを解明することを目指した。[方法と結果]我々はRBタンパク質に結合するタンパク質に注目し、そのなかでRBタンパク質をユビキナチン化する活性を持つものをin-vivoのユビキチン化アッセイで検索した。その結果p53のユビキチンリガーゼであるMdm2がRBタンパク質に結合し、ユビキチン化することを見出した。興味深いことにMdm2は、RBファミリーの中でRBタンパク質だけを特異的にユビキチン化し、p107やp130とは結合するがユビキチン化しないことが判明した。また、ARFはMdm2の活性を阻害し、RBタンパク質のユチビキチン化を抑制した。細胞にMdm2を過剰発現するとRBタンパク質の分解速度が亢進した。プロテアソーム阻害剤やドミナントネガティブMdm2あるいはMdm2のsiRNAによってRBタンパク質の分解が阻害された。また、RBタンパク質はMdm2ノックアウトMEFで蓄積し、ARFノックアウトMEFで発現低下(分解亢進)していた。SaO2細胞を用いたRB経路の機能アッセイにより、Mdm2によりRB経路が抑制されることが判明した。また、RBタンパク質をユビキチン化できない変異型Mdm2はソフトアガーコロニー形成能が低下していた。さらにヒトのMdm2が高発現している癌検体においては、RBの発現量が有意に低いとが分かった。以上の結果から、Mdm2によるRBの分解亢進は細胞癌化に寄与していることが判明した。

[研究目的]RB蛋白是重要的抑癌基因产物之一，其活性主要受磷酸化修饰控制。然而，迄今为止，人们对RB蛋白的定量控制机制知之甚少。在本研究中，我们旨在阐明磷酸化对RB蛋白活性的调节及其细胞内降解机制，并阐明其与细胞恶性肿瘤的参与。 [方法与结果] 我们关注与RB蛋白结合的蛋白质，并通过体内泛素化实验寻找具有泛素化RB蛋白活性的蛋白质。结果，我们发现 Mdm2（一种 p53 泛素连接酶）与 RB 蛋白结合并将其泛素化。有趣的是，Mdm2被发现仅特异性泛素化RB家族中的RB蛋白，虽然它与p107和p130结合，但它并不泛素化。此外，ARF 抑制 Mdm2 活性并抑制 RB 蛋白的泛素化。细胞中Mdm2的过度表达加速了RB蛋白的降解速度。蛋白酶体抑制剂、显性失活 Mdm2 或 Mdm2 siRNA 抑制 RB 蛋白降解。此外，RB蛋白在Mdm2敲除的MEF中积累，而在ARF敲除的MEF中其表达减少（降解增加）。使用 SaO2 细胞对 RB 途径进行的功能分析表明，Mdm2 抑制 RB 途径。此外，突变体Mdm2不能泛素化RB蛋白，其形成软琼脂菌落的能力降低。此外，在人Mdm2高表达的癌症样本中，RB的表达水平显着降低。从以上结果可知，Mdm2对RB的降解增强有助于细胞癌变。