RNA干渉および多重発光マクロアレイを併用したダイズ脂質生合成遺伝子の網羅的解析

RNA干扰和多重发光宏阵列综合分析大豆脂质生物合成基因

基本信息

批准号：
14760005
负责人：
穴井豊昭
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Saga University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760005/
关键词：
ダイズ貯蔵脂質脂肪酸不飽和化酵素 RNA干渉マクロアレイ

项目摘要

本年度は、昨年作成したダイズ(農林2号)未熟種子由来の完全長cDNAライブラリーから得られた、重複を省いた389クローンを選抜しマクロアレイを作成した。続いてこのマクロアレイシステムのテストを行うため、異なるステージのダイズ未熟種子(<5mm,5〜7mm,7〜9mm及び≧10mm)、葉、花、根からmRNAを抽出し、アンカーを介したRT-PCR法によりジゴキシゲニン(DIG)標識のcDNAプローブを作成し、ハイブリダイゼーションに用いた。この画像データをFAS-1000によりコンピュータ上に取り込み、画像解析ソフトImageQuantを用いて定量した結果、本方法はRIを用いた方法と同等の検出感度を持つことが明らかになった。また、発現量に変化が認められたもののうち56クローンを抽出してノーザンブロット分析により妥当性を検証したところ、5倍以上のシグナル強度の差を示したクローンについては、約85%のもので両方法での解析結果が一致した。そこで、主要な貯蔵タンパク質である7S及び11Sグロブリンが欠失した系統の解析を行った結果、リポキシゲナーゼ、オレオシン、FAD3といった脂質代謝関連遺伝子の一部について発現が有意に上昇してことが明らかとなった。また、昨年から引き続き行っているDGATおよびFAD3遺伝子のRNAi誘導個体は、それぞれ数系統のハイグロマイシン耐性個体が得れたが、稔性が低く、殆ど種子が得られておらず、解析には至っていない。これらの解析を進めるためには、今後、ダイズの形質転換法の更なる改良が必要であると考えられた。

今年，我们选择了389个克隆，这些克隆是从去年从未成熟种子的未成熟cDNA文库中创建的，这些克隆是从Dies（农业和林业2号）获得的，并创建了一个大宏。接下来，为了测试这个宏观的系统，面团不成熟的种子（<5mm，5-7mm，7-9mm和10 mm），从叶子，花和根中提取mRNA，并通过锚固通过-PCR方法创建了二高古素（DIG）标志，并用于杂交。此图像数据是在带有FAS-1000的计算机上导入的，并使用图像分析软件图像进行了量化，发现该方法具有与使用RI的方法相同的检测灵敏度。此外，提取了56个克隆的有效性，并通过对表达式变化的北面印迹分析来验证有效性，约为信号强度差异超过5倍的克隆的85％。方法匹配。因此，由于对主要储存蛋白，7s和11s球蛋白，脂氧合酶，Oleshin，FAD3等的分析，很明显，某些脂质代谢相关的基因显着增加。此外，自去年以来一直进行的RNAi诱导的DGAT和FAD3基因的个体已经获得了多种系统的许多高凝固性抗性个体，但生育力较低，几乎没有种子，并且进行了分析。不存在。为了促进这些分析，人们认为将来将进一步改善潜水员的转型。