RNA干渉および多重発光マクロアレイを併用したダイズ脂質生合成遺伝子の網羅的解析

RNA干扰和多重发光宏阵列综合分析大豆脂质生物合成基因

基本信息

批准号：
14760005
负责人：
穴井豊昭
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Saga University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760005/
关键词：
ダイズ貯蔵脂質脂肪酸不飽和化酵素 RNA干渉マクロアレイ

项目摘要

本年度は、昨年作成したダイズ(農林2号)未熟種子由来の完全長cDNAライブラリーから得られた、重複を省いた389クローンを選抜しマクロアレイを作成した。続いてこのマクロアレイシステムのテストを行うため、異なるステージのダイズ未熟種子(<5mm,5〜7mm,7〜9mm及び≧10mm)、葉、花、根からmRNAを抽出し、アンカーを介したRT-PCR法によりジゴキシゲニン(DIG)標識のcDNAプローブを作成し、ハイブリダイゼーションに用いた。この画像データをFAS-1000によりコンピュータ上に取り込み、画像解析ソフトImageQuantを用いて定量した結果、本方法はRIを用いた方法と同等の検出感度を持つことが明らかになった。また、発現量に変化が認められたもののうち56クローンを抽出してノーザンブロット分析により妥当性を検証したところ、5倍以上のシグナル強度の差を示したクローンについては、約85%のもので両方法での解析結果が一致した。そこで、主要な貯蔵タンパク質である7S及び11Sグロブリンが欠失した系統の解析を行った結果、リポキシゲナーゼ、オレオシン、FAD3といった脂質代謝関連遺伝子の一部について発現が有意に上昇してことが明らかとなった。また、昨年から引き続き行っているDGATおよびFAD3遺伝子のRNAi誘導個体は、それぞれ数系統のハイグロマイシン耐性個体が得れたが、稔性が低く、殆ど種子が得られておらず、解析には至っていない。これらの解析を進めるためには、今後、ダイズの形質転換法の更なる改良が必要であると考えられた。

今年，我们选择了389个没有重复的克隆，并从去年创建的未成熟大豆（2号农业）衍生而成的全长cDNA库中获得，以创建宏观阵列。为了测试该大型阵列系统，从未成熟的大豆种子（<5mm，5-7mm，7-9mm和≧10mm）中提取mRNA，不同阶段的叶子，花朵和根，以及通过锚定介导的RT-PCR制备了标记的二高氧素（Digoxigigenin（Dig）标记的CDNA探针，并用于卫生化。使用FAS-1000将该图像数据导入到计算机上，并使用图像分析软件ImageQuant进行了量化，并且发现该方法具有与使用RI的方法相同的检测灵敏度。此外，提取了56个具有表达水平变化的克隆，并通过Northern印迹分析进行了验证。对于表现出5次信号强度差异的克隆，发现大约85％的克隆与使用这两种方法的分析结果一致。因此，对从主要储存蛋白7和11S球蛋白中删除的线的分析表明，某些与脂质代谢相关的基因（例如脂氧合酶，油蛋白和FAD3）的表达显着增加。此外，自去年以来一直持续的DGAT和FAD3基因的RNAI诱导的个体已经达到了几个耐毒素的个体，但生育能力很低，几乎没有种子，并且尚未获得分析。人们认为，将来需要进一步改进大豆转型方法，以进行这些分析。