ヒメツリガネゴケを用いた細胞の極性形成および不等分裂に関わる遺伝子の単離と解析

利用苔藓植物立碗藓分离和分析参与细胞极性形成和不等分裂的基因

基本信息

批准号：
14740446
负责人：
藤田知道
金额：
$ 3.07万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14740446/
关键词：
不等分裂細胞極性プロトプラスト再生 GFP RNA干渉完全長cDNA 過剰発現細胞分化 EST

项目摘要

完全長cDNAの一過的過剰発現により、偏光下におけるプロトプラストの極性形成や不等分裂に異常をもたらす原因遺伝子群を同定する。(1)本年度新たに完全長cDNA約1000種類の一過的過剰発現によるプロトプラスト再生異常のスクリーニングを行い、細胞極性や不等分裂に関わる遺伝子群の一次候補を同定した。(2)これまでのスクリーニングで得られた一次候補クローンにおいて、表現型の再現性を確認し、不等分裂が等分裂になるもの、不等分裂がおこらず等方位的に細胞が巨大化するものなど細胞極性形成や不等分裂異常に関わると考えられる原因遺伝子を最終的に57種類に絞ることができた。これらcDNAの全長の塩基配列を決定し相同性検索やドメイン解析を行った結果、10種類が既知の極性因子や不等分裂因子と類似していることがわかった。また、機能未知の遺伝子、どの遺伝子とも類似性を示さなかったものも含まれていた。(3)極性形成や不等分裂は、その過程に関わっている蛋白質自体の極性分布がその作用発現に必須である例が知られている。得られた候補遺伝子とGFP (Green Fluorescence Protein)の融合遺伝子を作成し、プロトプラストで一過的に過剰発現させることにより、融合蛋白質の細胞内局在を調べた。いくつかにおいて原糸体基部に局在するものなどを同定した。(4)RNA干渉により候補遺伝子の機能抑制時における表現型を調べる。そのためのコンストラクト作りを開始した。このコンストラクトでRNA干渉が実際に働くことをヒメツリガネゴケプロトプラスト再生系において確認した。(3)(4)により、候補遺伝子の不等分裂に関わる機能解析を進めていく。

通过全长 cDNA 的瞬时过表达，我们将鉴定导致极性形成异常和偏振光下原生质体不均等分裂的基因。 (1)今年，我们通过约1000个全长cDNA的瞬时过表达对异常原生质体再生进行了新的筛选，并鉴定了涉及细胞极性和不等分裂的基因的主要候选基因。 (2)确认前期筛选得到的一级候选克隆的表型重现性，发现不等分裂变为等分裂，细胞在不等分裂的情况下各向同性生长，最终缩小了致病原因。被认为与细胞极性形成和不等分裂异常有关的基因至 57.在确定这些cDNA的全长核苷酸序列并进行同源性搜索和结构域分析后，我们发现其中10个与已知的极性因子和不等分裂因子相似。还包括功能未知的基因和与任何基因都没有相似性的基因。 (3)在极性形成和不均等分裂中，已知参与该过程的蛋白质本身的极性分布对于其效应的表达至关重要。制作所获得的候选基因与GFP(绿色荧光蛋白)的融合基因，并通过在原生质体中瞬时过表达该融合蛋白来研究其细胞内定位。在某些情况下，我们发现了位于原丝体底部的那些。 (4)检查候选基因的功能被RNA干扰抑制时的表型。我们开始为此目的创建一个构造。我们证实，RNA 干扰实际上在立碗藓原生质体再生系统中对这种构建体起作用。基于(3)和(4)，我们对与不等分裂相关的候选基因进行功能分析。