ヒメツリガネゴケを用いた細胞の極性形成および不等分裂に関わる遺伝子の単離と解析

利用苔藓植物立碗藓分离和分析参与细胞极性形成和不等分裂的基因

基本信息

批准号：
14740446
负责人：
藤田知道
金额：
$ 3.07万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14740446/
关键词：
不等分裂細胞極性プロトプラスト再生 GFP RNA干渉完全長cDNA 過剰発現細胞分化 EST

项目摘要

完全長cDNAの一過的過剰発現により、偏光下におけるプロトプラストの極性形成や不等分裂に異常をもたらす原因遺伝子群を同定する。(1)本年度新たに完全長cDNA約1000種類の一過的過剰発現によるプロトプラスト再生異常のスクリーニングを行い、細胞極性や不等分裂に関わる遺伝子群の一次候補を同定した。(2)これまでのスクリーニングで得られた一次候補クローンにおいて、表現型の再現性を確認し、不等分裂が等分裂になるもの、不等分裂がおこらず等方位的に細胞が巨大化するものなど細胞極性形成や不等分裂異常に関わると考えられる原因遺伝子を最終的に57種類に絞ることができた。これらcDNAの全長の塩基配列を決定し相同性検索やドメイン解析を行った結果、10種類が既知の極性因子や不等分裂因子と類似していることがわかった。また、機能未知の遺伝子、どの遺伝子とも類似性を示さなかったものも含まれていた。(3)極性形成や不等分裂は、その過程に関わっている蛋白質自体の極性分布がその作用発現に必須である例が知られている。得られた候補遺伝子とGFP (Green Fluorescence Protein)の融合遺伝子を作成し、プロトプラストで一過的に過剰発現させることにより、融合蛋白質の細胞内局在を調べた。いくつかにおいて原糸体基部に局在するものなどを同定した。(4)RNA干渉により候補遺伝子の機能抑制時における表現型を調べる。そのためのコンストラクト作りを開始した。このコンストラクトでRNA干渉が実際に働くことをヒメツリガネゴケプロトプラスト再生系において確認した。(3)(4)により、候補遺伝子の不等分裂に関わる機能解析を進めていく。

全长cDNA的瞬时过表达鉴定导致极化下原生质体的极化和不平等分裂的病因基因。（1）今年，由于大约1,000种类型的全长cDNA的短暂过表达，我们筛选了异常原生质体再生，并确定了参与细胞极性和不平等分裂的基因组的主要候选物。（2）在通过先前筛选获得的主要候选克隆中证实了表型的可重复性，并且被认为与细胞极性形成和不平等分裂异常有关的病因基因，例如那些相等的分裂和导致大细胞的均等分裂和不相同的细胞是同性细胞的，以及那些在同性细胞中且细胞构成了较大的型号，并且在5个型号中变为较大的下降量。确定了这些cDNA的全长的核苷酸序列，并进行了同源搜索和域分析，发现10种类型类型类似于已知的极性和不等性的精神分裂因子。它还包括功能未知的基因以及与任何基因没有相似性的基因。（3）极性形成和不平等的分裂是已知的例子，在该过程中，参与该过程的蛋白质的极性分布对于它们对作用的影响至关重要。创建了获得的候选基因和GFP（绿色荧光蛋白）融合基因，并在原生质体中瞬时过表达，以检查融合蛋白的亚细胞定位。确定了一些位于原始元素碱基的位置。（4）通过RNA干扰研究候选基因的功能抑制功能期间的表型。我们已经开始为此目的创建构造。它在该构建体中RNA干扰的再生系统中得到了证实。（3）和（4）将进行与候选基因不平等分裂有关的功能分析。