プロテオーム解析の高速化と高性能化を指向したシリカ連続体カラムの開発

开发硅胶连续柱，旨在加速和提高蛋白质组分析的性能

基本信息

批准号：
14740403
负责人：
池上亨
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Kyoto Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究課題の目的は、タンパク質の高速・高性能分離である。これには、逆相型カラムの他にイオン交換型カラムやサイズ排除型カラム、アフィニティ型カラムが必要とされる。これらの機能をシリカモノリス型カラムに付与するために、種々のシランを用いてオンカラム反応によるシリカ骨格の表面修飾法を確立することである。今年度は、イオン交換型、サイズ排除型の機能を有するシリカモノリス型カラムの調製法を種々検討し、表面修飾の方法を確立し、標準タンパク質サンプルへの適用を行った。(1)3-ジエチルアミノ-2-ヒドロキシプロピルメタクリレートをラジカル重合することにより陰イオン交換型カラムを作成した。電子顕微鏡での観察結果より、重合後は明らかにシリカ骨格が太くなっていることがわかった。このカラムでヌクレオチド(5'-UMP、5'-CMP、5'-AMP、5'-GMPの4種)の分離を試みた。これらは効率よく分離された。参考にした市販カラム(Shodex AXpack WA-624)の分析例とほぼ一致した。シリカモノリスキャピラリーカラムの方は分離性能が格段に優れでいることがわかった。30センチ程度のカラムで5'-CMPや5'-UMPでは、それぞれ理論段数25000段が得られている。また、市販カラムは60度の分離条件で比較的良い理論段数を得ているのに対し、シリカモノリスキャピラリーカラムは室温で高理論段数が得られているのも大きな特徴の一つであることが示された。(2)1と同様にアクリルアミドを重合することによって、タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを調製した。移動相にリン酸緩衝液(pH7.1)を用いて分子量キャリブレーション用の10種のタンパク質(分子量1万2千〜40万)の分離を行なったところ、溶出はおおむね分子量の大きいものから小さいものの順番で起こった。シリカ骨格へのタンパク質の非特異的な吸着が抑えられているものと考えられるが、完全なサイズ排除条件での分析には至っていないのが現状である。

该研究主题的目的是快速且高度性能的蛋白质分离。除了相反的相位列之外，这还需要一个离子交换列，大小排除列和一个亲和力列。为了将这些功能传达给二氧化硅整体型柱，是建立一种使用各种硅烷在柱上反应中修饰二氧化硅骨架表面的方法。今年，研究了用于制备具有离子 - 交换和尺寸排斥功能的二氧化硅整体型柱的各种方法，并确定了表面修饰方法，并将应用于标准蛋白质样品。（1）通过3-二乙基氨基-2-羟基丙烯酸酯的3-二乙基氨基氨基甲基丙烯酸酯的自由基聚合制备了一个阴离子交换柱。电子显微镜下的观察结果表明，聚合后二氧化硅骨骼明显较厚。在此列中尝试了核苷酸（4种：5'-ump，5'-CMP，5'-AMP和5'-GMP）。这些是有效分开的。这几乎与被用作参考的市售列（Shodex Axpack WA-624）的分析示例一致。已经发现，二氧化硅整体毛细管柱具有明显优越的分离性能。约30厘米的一列约为5'-cmp，每个柱子都有25,000个阶段的理论数量。还已经显示，在60°C的分离条件下，可获得相对较好的理论板数的主要特征之一是它们获得了相对较好的理论板数，而硅胶毛细管柱可以在室温下获得高理论板数。（2）通过与1中相同的方式聚合丙烯酰胺来制备蛋白质大小的排除色谱柱。当将10种蛋白质（分子量12,000至400,000）分开以进行分子量校准，使用流动相中的分子量校准，在较高至较低的分子量的顺序中，流动相通常发生。人们认为，蛋白质对二氧化硅骨架的非特异性吸附受到抑制，但目前的情况是尚未达到完全尺寸排除条件下的分析。