Bacteroides forsythusのS-layer関連遺伝子領域の解析

福赛拟杆菌S层相关基因区域分析

• 批准号: 14771071
• 负责人: 樋口 直也
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Aichi Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14771071/
• 关键词: T.forsythensis; B.forsythus; S-layer; 高分子蛋白質

前年度までに、T.forsythensis (B.forsythus)におけるS-layer遺伝子の欠損変異株を作製するためのプラスミドを作製し、数種類の制限酵素処理後の泳動パターンにより目的のプラスミドであることを確認していた。そこで、今年度はそのプラスミドを用いて、実際にS-layer欠損変異株を作製し、関連遺伝子領域の解析および機能分析を行う予定であった。T.forsythensisと、目的のプラスミドを含む大腸菌、およびヘルパーとなる大腸菌RK231を、N-アセチルムラミン酸添加血液寒天培地にて好気条件下、37℃で、18時間接合させた。回収後、N-アセチルムラミン酸添加血液寒天培地(ゲンタマイシン200μg/ml、テトラサイクリン1μg/ml)に拡げ、嫌気条件下、37℃で14日間培養した。しかし、変異株は得られなかった。そこで、方法を変更し、S-layer遺伝子をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に置換することとした。この結果、(a)230kDa蛋白質をコードする遺伝子のみを置換した変異株、(b)270kDa蛋白質をコードする遺伝子のみ置換した変異株、および(c)その両遺伝子を置換した変異株を得ることができた(SDS-PAGEおよび制限酵素処理後のDNAの電気泳動によって確認済み)。現在までに、血液寒天培地上でのコロニー形態観察、グラム染色による細菌形態観察、ネガティブ染色による細菌形態観察を行い、特筆すべき変化は認められなかったが、透過型電子顕微鏡にて(a)(c)においてS-layerの完全な欠損、(b)においてほぼ欠損していることが確認できた。今後、各細菌の病原性およびヒト細胞を用いた付着実験を行っていく予定である。

到了前一年，我们已经创建了一个质粒来创建缺乏S层基因的福赛斯木霉（B.forsythus）突变株，并根据几种类型的处理后的迁移模式确认它是所需的质粒。我正在做限制性内切酶。因此，今年我们计划利用该质粒实际构建S层缺陷突变株，并进行相关基因区域分析和功能分析。 T. forsythensis、含有所需质粒的大肠杆菌和辅助大肠杆菌 RK231 在补充有 N-乙酰胞壁酸的血琼脂培养基上于 37°C、需氧条件下缀合 18 小时。收集后，涂布于添加有N-乙酰胞壁酸(庆大霉素200μg/ml、四环素1μg/ml)的血琼脂培养基上，37℃、厌氧条件下培养14天。然而，没有获得突变株。因此，我们决定改变方法，用氯霉素乙酰转移酶基因替换S层基因。结果，可以获得(a)仅编码230kDa蛋白质的基因被替换的突变株、(b)仅编码270kDa蛋白质的基因被替换的突变株、以及(c)两个基因均被替换的突变株（通过限制酶处理后的 SDS-PAGE 和 DNA 电泳证实）。迄今为止，我们在血琼脂平板上观察了菌落形态，用革兰氏染色观察了细菌形态，用阴性染色观察了细菌形态，但没有观察到显着的变化；然而，用透射电子显微镜（a）证实了S (c)中完全缺失-层，(b)中几乎完全缺失。未来，我们计划利用人体细胞对每种细菌的致病性及其粘附性进行实验。