プロテオーム解析を用いた、新たな内耳感染防御機構の解明

使用蛋白质组分析阐明针对内耳感染的新防御机制

基本信息

批准号：
14770931
负责人：
長谷川純
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770931/
关键词：
外リンパ内耳感染防御感染防御機構

项目摘要

我々は、2次元電気泳動による外リンパのプロテオーム解析を行っている。Cochlin蛋白のLCCLモチーフ配列に対する抗体を2種類作成し、抗LCCL-N末端抗体、抗LCCL-C末端抗体とした。これを用いた1次元ウェスタンブロッティングにより、外リンパ中に新規タンパクCochlin-Tomoprotein(CTP)(以前我々がPLP16K蛋白と呼んでいたもの)を検出した。CTPの前駆産物であるCOCH蛋白は分子量、等電点が異なる全部で16個のアイソフォームから構成されていた。従ってCTPも燐酸化、糖鎖の付加などの様々な翻訳後修飾を受けている可能性がある。そこで、先ずこの蛋白の発現を2次元電気泳動により解析する目的で実験を行った。ウシ外リンパを採取し、蛋白を20倍体積のホモジェネート液で抽出した。2次元電気泳動には固定化pH勾配ゲルストリップ(Immobiline pH3-10)を用いた。1次元目に尿素変性条件下で等電点泳動をMultiphorIIで行い、2次元目にSDS変性下で平板ゲル電気泳動を行った。この結果、外リンパ特異的な泳動パターンが得られ,これは内耳蛋白の泳動パターンとは全く異なっていた。20ulの外リンパを泳動し、抗LCCL-N末端抗体、抗LCCL-C末端抗体でウェスタンブロッティングを行ったところ、陽性スポットが検出された。この陽性スポットは、酸性側にCTP(pH7.7)分子量18.8から23.1kDa、アルカリ性側にCTP(pH7.9)分子量17.7から22kDaであり、CTPのアイソフォームと考えられた。今後、そのアミノ酸配列を解読し、PLP16K蛋白の蛋白レベルでの特徴、前駆産物であるCOCH蛋白との関連性を明らかにする。さらにCTPの機能について検討していく。

我们通过2D电泳对围绕perilymphs进行蛋白质组学分析。准备两种类型的抗体，以对Cochlin蛋白的LCCL基序序列，并用作抗LCCL-N-末端抗体和抗LCCL-C-C-末端抗体。这种一维蛋白质印迹用于检测PerilyMPH中的新型蛋白质Cochlin-Tomoprotoin（CTP）（我们以前称为PLP16K蛋白）。 COCH蛋白是CTP的前体，由16个同工型组成，分子量不同，分子量不同。因此，CTP还可以进行各种翻译后修饰，例如磷酸化和添加聚糖。因此，首先，进行了一个实验，以通过2D电泳分析该蛋白的表达。收集牛的牛，并用20倍均匀的匀浆溶液提取蛋白质。二维电泳使用固氨酸pH梯度凝胶条（Immobiline pH 3-10）。在尿素定性条件下使用多智能II在第一个维度上进行等电点的光孔，并在SDS贬低下在第二维中进行板凝胶电泳。这导致了圆锥形的模式，这与内耳蛋白的运动模式完全不同。运行20 ul的perilymph，并用抗LCCL-N-末端抗体和抗LCCL-C-C末端抗体进行蛋白质印迹，并检测到阳性斑点。该正点的CTP（pH 7.7）的分子量为18.8至23.1 kDa，在碱侧的CTP（pH 7.9）的分子量为17.7至22 kDa，被认为是CTP的同工型。将来将对氨基酸序列进行解码，以阐明PLP16K蛋白在蛋白水平上的特征及其与前体产物Coch蛋白的关系。我们还将考虑CTP的功能。