放線菌の新規遺伝子プロモーターの機能開発

放线菌新型基因启动子的功能发育

基本信息

批准号：
13760233
负责人：
橋本義輝
金额：
$ 1.34万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760233/
关键词：
プロモーター遺伝子発現

项目摘要

Rhodococcu rhodocurous J1菌由来のタンパク質誘導発現系(ニトリルヒドラターゼ系)が既に取得されているが、本系を利用した場合、尿素を誘導剤とした場合に50%以上を占めるほどニトリルヒドラターゼ(ニトリルをアミドに分解する酵素)が著量発現する。一般的に利用されている大腸菌での発現系ではRhodococcus属由来の遺伝子はしばしば発現しないことが認められていることから、Rhodococcus属由来の酵素による有用物質生産などを考えた場合、Rhodococcus属を宿主とする大量発現系が必要となる。Rhodococcus属放線菌内で複製するプラスミドにニトリルヒドラターゼ遺伝子周辺領域を連結・導入し、J1菌とは別のRhodococcus属放線菌において発現するかを確認した。その結果、(構成的ではあるが)ニトリルヒドラターゼの高発現が確認できたことから高発現ベクターを構築できる可能性が示唆された。次に、産業上有用な特徴を有するロドコッカス属放線菌の宿主としての利用を目指し、遺伝子組換え系(宿主・ベクター系)の開発を試みた。当研究室保有のロドコッカス属放線菌、および理化学研究所微生物系統保存施設(JCM)と独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源センター(NBRC、旧IFO)から購入した計40株以上のロドコッカス属放線菌を対象として、プラスミドを検索したところ、数種のプラスミド保有株がスクリーニングできた。

已经获得了源自红红球菌J1细菌的蛋白质诱导表达系统（腈水合酶系统），但是当使用该系统时，腈水合酶（腈分解成酰胺的酶）显着表达。人们认识到源自红球菌属的基因通常不能在常用的使用大肠杆菌的表达系统中表达，因此需要大规模的表达系统。将腈水合酶基因周围的区域连接并导入到在红球菌属放线菌中复制的质粒中，并确认其是否会在与J1细菌不同的红球菌属放线菌中表达。结果，确认了腈水合酶的高表达（尽管是组成型的），这表明构建高表达载体的可能性。接下来，我们尝试开发一种基因重组系统（宿主-载体系统），目的是使用具有工业上有用的特性的红球菌属放线菌作为宿主。我们实验室拥有的红球菌放线菌，以及从理化学研究所微生物系统保藏中心 (JCM) 和国立技术评估研究所 (NBRC，以前的 IFO) 购买的 40 多个红球菌菌株。筛选几种类型的质粒携带菌株。