微生物によるN3化合物分解代謝

N3化合物被微生物分解代谢

基本信息

批准号：
19651028
负责人：
橋本義輝
金额：
$ 2.18万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19651028/
关键词：
微生物分解代謝酵素

项目摘要

本研究では、N3化合物を分解する酵素を分子レベルで解析し、得られる情報を基に、これらの物質を効率よく無害化あるいは有用物に安全に変換する生物を新規に育種することを目的とした。自然界からN3化合物分解菌としてスクリーニングを行い、前年度決定したN3化合物分解活性が最大となる最適培養条件で菌体を用いてN3化合物分解の精製を行った。菌体を破砕し、無細胞抽出液を調製した時点でN3化合物分解活性は確認できたが、その活性は低く、さらにN3化合物分解酵素は不安定であることが判明した。大量の無細胞抽出液を調製し、そこからN3化合物分解活性を指標に、精製を開始し無細胞抽出液を硫安で分画後、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーを組み合わせてN3化合物分解酵素の精製を試みているが、現在、SDS-PAGE上で単一バンドになるレベルまで精製は完了していない。N3化合物分解酵素の精製が困難であると考えられたため、本酵素の精製と並行しながら、別の方法でのN3化合物分解酵素の取得を試みた。トランスポゾンによる遺伝子導入技術を利用して、本N3化合物分解菌の染色体に直接抗生物質耐性遺伝子をランダムに導入し、多数の抗生物質耐性株の中から、N3化合物分解能を示さなくなった変異株を取得するために、まず、本N3化合物分解菌が保有しない抗生物質耐性遺伝子を調べる必要があり、本年度では、スクリーニングしたN3化合物分解菌の薬剤耐性・感受性を調査した。

这项研究的目的是在分子水平上分析降解 N3 化合物的酶，并根据获得的信息培育出能够有效使这些物质无害或安全地将其转化为有用物质的新生物。我们从自然界中筛选了N3化合物降解细菌，并在最佳培养条件下利用细菌细胞纯化了N3化合物分解物，使前一年确定的N3化合物降解活性最大化。虽然当破碎细菌细胞并制备无细胞提取物时确认了N3化合物分解活性，但活性低，此外，发现N3化合物降解酶不稳定。制备大量的无细胞提取物，并用硫酸铵、阴离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱等分级分离无细胞提取物后，以N3化合物分解活性为指标开始纯化。正在尝试通过组合各种层析方法来纯化N3化合物降解酶，但纯化尚未完成到在SDS-PAGE上出现单一条带的水平。由于N3化合物降解酶的纯化被认为是困难的，因此我们尝试在纯化本酶的同时使用另一种方法获得N3化合物降解酶。利用基于转座子的基因导入技术，我们将抗生素抗性基因直接随机引入到该N3化合物降解菌的染色体中，从大量抗生素抗性菌株中获得了不再表现出降解N3化合物能力的突变菌株。为此，首先需要研究这种N3化合物降解菌不具有的抗生素抗性基因，今年，我们研究了我们筛选的N3化合物降解菌的耐药性和敏感性。