海藻用発現ベクターの開発とそれを利用した海藻ゲノムへの外来遺伝子導入

开发海藻表达载体并利用它们将外源基因引入海藻基因组

基本信息

批准号：
13760155
负责人：
柿沼誠
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者はこれまでに,不稔性アオサのアクチン遺伝子の全長を含む約12kbpのゲノムDNAの塩基配列解析により,アクチン遺伝子が5つのエクソンと4つのイントロンで構成されていること,翻訳開始および終結コドンがそれぞれ,第2および第5エクソンに存在すること,TATAボックスが転写開始点から30bp上流に,polyA付加配列が終結コドンから100bp下流に位置すること,等を明らかにしている。そこで,終結コドンから3'側約1.5kbpのDNA断片を,クロンテック社製プラスミドベクターpEGFPに含まれるGreen Fluorescent Protein(GFP)レポーター遺伝子の下流に挿入し,pEGFP-ACTを作製した。次いで,第1エクソンからプロモーター領域を含む5'側約1.2kbpのDNA断片,或いは第2エクソンの開始コドンからプロモーター領域を含む5'側約1.4kbpのDNA断片を各々pEGFP-ACTレポーター遺伝子の上流に挿入し,2種類の発現ベクターpEGFP-PSACTおよびpEGFP-PLACTを構築した。次に,構築した2種類の発現ベクターをバイオラッド社製PDS-1000/He Particle Delivery Systemを用いて種々の条件で不稔性アオサ細胞内に導入した。その結果,発現ベクターを直径1.0μmの金製マイクロキャリアにコーティングし,ヘリウム圧1300又は1550psi,サンプル距離6cmの条件で導入した場合に,細胞内に多数のマイクロキャリアが観察された。さらに,導入24時間後の細胞を蛍光顕微鏡を用いて観察したところ,いずれの発現ベクターを導入した場合でも,GFP由来の蛍光を発する細胞が数個確認された。また,GFP由来の蛍光強度の比較により,pEGFP-PSACTが細胞内でより強い発現性を示すことを明らかにした。今後は,より高効率で安定した形質転換体を得るための導入方法を確立すると共に,Luciferaseレポーター遺伝子を利用したプロモーター活性の測定により,導入外来遺伝子の発現に最適なプロモーター及びpolyA付加シグナル配列を決定する予定である。

申请人到目前为止，肌动蛋白基因由约12KBP的基本序列分析组成，包括约12 kbp的基因组DNA，包括Anemosta中的针灸基因的整体长度，并且翻译的开始和结束。第二和第五埃文森（Tata Box）位于转移起点的30 bp上游，Polya附加序列位于从端密码子到100bp的下游。因此，将末端密码子3'端的DNA片段插入了绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的下游，该基因包含在Crontech的质粒矢量PEGFP中。接下来，从第二个外显子开始的5'侧的1.2kbp DNA片段中的每个片段，包括第一个exonson或包括启动子区域的2.4kbp DNA片段在并构建了两种类型的表达矢量PEGFP-PSACT和PEGFP-PLACT。接下来，使用PDS-1000/HE粒子输送系统在各种条件下引入了两种类型的向量。结果，当将表达载体涂在直径为1.0μm的金微型载体中时，在细胞中观察到大量微虫，并在氦气1300或1550 psi的条件下引入并引入样品距离6厘米。此外，当引入后24小时使用荧光显微镜观察到细胞，即使引入任何表达载体，也确认了一些发出从GFP衍生的荧光的细胞。另外，从GFP得出的荧光强度的比较表明，PEGFP-PSACT在细胞中具有更强的表达。将来，通过建立一种引入更稳定和稳定的转化的方法，并使用荧光素酶报告基因来测量启动子活性，这是对引入门诊基因的表达最佳的启动子和多A添加信号序列决定。