ヘパラン硫酸/ヘパリン・脱N-アセチル/N-硫酸転移酵素の構造と機能の解析

硫酸乙酰肝素/肝素/脱N-乙酰基/N-磺基转移酶的结构与功能分析

基本信息

批准号：
13760077
负责人：
相川順一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

1.N-硫酸転移酵素ドメインの生産と解析前年度に得られたマウス・脱N-アセチル/N-硫酸転移酵素(NDST)1のN-硫酸転移酵素ドメインはヘパリンと高い親和性を示すものの、N-硫酸を含まないヘパロサンへの親和性はそれより低下していることが、表面プラズモン共鳴によって明らかになった。引き続き、ハエおよび線虫のN-硫酸転移酵素ドメインの大腸菌における発現系の構築を行ったが、マウスNDSTの生産量に比べ、ハエでは1/2、線虫では1/10に低下していた。アミノ酸コドンの片寄りが原因の一つと考えられたため、特定のtRNAが増強された大腸菌を宿主として生産を試みたが、相互作用を解析するのに必要な量は得られなかった。2.局在性解析を目指したマウス・NDSTの安定発現細胞の樹立前年度までに、FLAGのタグをC末につけた形のマウス・NDST各アイソザイムの発現をCHO-K1細胞変異株において試みたが、樹立した細胞間では各アイソザイムの発現が不均一であった。そこで、外来遺伝子を染色体の特定の部位に挿入でき、なおかつその発現を薬剤(テトラサイクリン等)によって制御できる系の利用を試みた。HEK293細胞で樹立した各アイソザイムのクローンでは、その発現が薬剤依存的であったが、アイソザイムの発現は、相対的にNDST1、2で高く、NDST3、4で低かった。現在、アイソザイムの発現量を揃えるため、濃度依存的な発現が誘導可能な薬剤(ドキシサイクリン)を用いた実験を行っている。3.脱N-アセチル酵素ドメインの構造と機能の解析キチン・脱N-アセチル酵素など他の脱N-アセチル酵素とのアミノ酸配列の相同性を利用して、ヒトNDST3の脱N-アセチル化反応に関わるアミノ酸残基の同定を行うため、10ケ所の部位の特異的変異を行った。既に、発現可能な形に構築し終えており、現在発現細胞の樹立を行っている。

1。对N-硫酸盐转移酶结构域的产生和分析。上一年获得的小鼠DEN-乙酰/N-硫酸盐转移酶（NDST）1的N-硫酸盐转移酶结构域显示出对肝素的高亲和力，但其对无N-硫酸盐的肝素的亲和力降低。随后，在大肠杆菌中构建了蝇和线虫的N-硫酸酶结构域的表达系统，但是与小鼠NDST的产生相比，结果在蝇中降低了1/2，在线虫中降低了1/10。由于它被认为是氨基酸密码子不均匀的原因之一，因此我们试图产生大肠杆菌（一种特定的tRNA增强大肠杆菌）作为宿主，但没有获得分析相互作用所需的量。 2.到建立小鼠NDST细胞稳定表达的前一年，旨在分析定位的小鼠NDST细胞，我们试图表达每种小鼠NDST同工酶，其在CHO-K1细胞突变株中附着在C-k1细胞突变株中的FLAG标签，但是每个同酶的表达在既定细胞中都是异质的。因此，我们试图使用允许外源基因插入染色体上的特定位点的系统，并允许通过药物控制基因的表达（例如四环素）。在HEK293细胞中建立的每个同工酶克隆中，其表达依赖性药物依赖性，但在NDST1、2中的同工酶表达相对较高，NDST3，4。当前，正在使用药物（doxycycline）进行实验，可以使用药物（doxycycline）诱导浓度依赖浓度依赖于同酶表达水平的表达水平。 3。分析DEN-乙酰酶结构域的结构和功能。进行了10个位点的特异性突变，以鉴定与其他DEN-乙酰基酶（如几丁质和DEN-乙酰酶）的同源性，以鉴定人NDST3与人NDST3的DEN-乙酰反应。这些细胞已经被构造成表达形式，目前正在建立以表达细胞。