NADPの合成と分解に関わる細菌酵素の性状とその進化過程の解析

NADP合成与分解相关细菌酶的性质及进化过程分析

基本信息

批准号：
13760068
负责人：
河井重幸
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

生体内NADPレベルは、NADをリン酸化してNADPを生合成するATP特異型NADキナーゼと、NADPを脱リン酸化してNADとリン酸を生成する細胞質性NADPフォスファターゼ(NADPase)によって制御されている。しかし、細胞質性NADPaseの精製例がないため、生体内NADPレベルの制御機構は全く未知であった。一方、自然界には、ATP特異型NADキナーゼの他に、ATP以外にポリリン酸を利用するポリリン酸/ATP-NADキナーゼ(P/A-NK)も存在する。ポリリン酸は原始地球下で容易に生成し得たため、両NADキナーゼの構造生物学的研究を通じて、ポリリン酸からATPへ至る生体エネルギー担体の化学進化過程と、それに連動したであろうタンパク質・遺伝子の進化過程に関して重要な知見が得られると予想される。以上の背景に基づき、本申請研究では(1)細胞質性NADPaseの精製とその酵素科学的性質の決定、並びに(2)P/A-NK立体構造の決定を目的として研究を行い、以下の実績を得た。(1)細胞質性NADPaseの精製とその酵素科学的性質の決定:土壌分離菌Arthrobacter sp.KM株の細胞抽出液より、2種類のNADPase(NADPaseI、NADPaseII)を精製し、両酵素の酵素科学的性質を決定した。両酵素共に、人工基質p-ニトロフェニルリン酸に対して強く作用した。しかし、生体関連物質の中では、NADPとNADPHに対して良好に作用したため、両酵素は、これまでに正体不明であった細胞質性NADPaseであることが判った。(2)P/A-NK立体構造の決定:P/A-NK、並びにその重原子同型置換体のX線回折データの処理を終了した。そして、得られたデータに基づき、P/A-NKアポ型立体構造のモデリングを開始した。現在、モデリングが進行中であり、P/A-NKの概略的な立体構造を得た。

体内 NADP 水平由 ATP 特异性 NAD 激酶和细胞质 NADP 磷酸酶 (NADPase) 控制，其中 ATP 特异性 NAD 激酶使 NAD 磷酸化并生物合成 NADP，而细胞质 NADP 磷酸酶则使 NADP 去磷酸化以生成 NAD 和磷酸盐。然而，由于没有纯化细胞质NADP酶的例子，体内控制NADP水平的机制完全未知。另一方面，在自然界中，除了ATP特异性NAD激酶之外，还存在除了ATP之外还利用多磷酸盐的多磷酸盐/ATP-NAD激酶（P/A-NK）。由于原始地球下很容易产生多磷酸盐，通过对两种NAD激酶的结构生物学研究，我们研究了生物能源载体从多磷酸盐到ATP的化学演化过程，以及与这一过程相关的蛋白质和基因。预计将获得有关进化过程的重要发现。基于上述背景，本应用研究旨在（1）纯化细胞质NADPase并测定其酶学性质，（2）确定P/A-NK三维结构，并有以下结果：我得到了。 (1)细胞质NADP酶的纯化及其酶学性质的测定：从土壤分离的节杆菌属菌的细胞提取物中纯化出两种类型的NADP酶(NADP酶I和NADP酶II)并测定其性质。两种酶都对人工底物磷酸对硝基苯酯有强烈作用。然而，由于它对生物相关物质中的NADP和NADPH具有良好的作用，因此确定这两种酶都是细胞质NADP酶，而此前其身份未知。 (2)P/A-NK三级结构的测定：我们已经处理完P/A-NK及其重原子同构替代物的X射线衍射数据。基于所获得的数据，开始对P/A-NK apo型三维结构进行建模。目前建模工作正在进行中，并且已经获得了P/A-NK的粗略三维结构。