細胞外環境に応答したNADP(H)/NAD(H)比制御の分子機構と生理的意義

细胞外环境响应NADP(H)/NAD(H)比例调节的分子机制及生理意义

基本信息

批准号：
19780057
负责人：
河井重幸
金额：
$ 2.35万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

NADP(H)とNAD(H)は膨大な生体内反応に関わり、且つ両補酵素の機能が全く異なるため、NADP(H)/NAD(H)比の変動は生体内代謝系および細胞活動に甚大な影響を及ぼすと予想される。同比制御の鍵となる酵素の一つがNADキナーゼ(NADK)である。しかし、生体内NADP(H)/NAD(H)比制御機構へのNADKの寄与に関しては、不明点が多く残されている。ほとんどの生物(大腸菌を除く)のNADKは、NADとNADHの両方をリン酸化する活性を示す。これは、NADKは、NADのリン酸化活性によるNADP合成またはNADHのリン酸化活性によるNADPHの合成を通じて、NADP(H)/NAD(H)比制御機に寄与し得ることを意味する。しかし、どちらの活性が生理的に重要であるかは不明であった。本研究により、真核生物のモデル生物である出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリア(Mit)型NADK(Pos5p)のNADHキナーゼ活性が、細胞の生育ならびにMitの機能に必須ではないことを明らかにした。すなわち、POS5のプロモーターの下流およびシグナル配列(Mitへの輸送に必要)の下流に、大腸菌由来NADK(YfjB:NADHのリン酸化活性を示さない)を連結したキメラプラスミドを構築し、これを酵母NADK三重欠損株yeflutrlpos5(ただしYCp-UTR1のはたらきにより致死とならない)に導入した。プラスミド・ジャフリングによりYCp-UTR1を欠落させたところ、酵母は生育性を示した。これは、酵母の生育性にNADHキナーゼ活性が必須ではないことを意味した。さらに、Mitの機能に関わる表現型も評価したところ、シグナル配列を有するYfjBがArg要求性と酸化ストレス感受性を相補したが、同配列を持たないYfjBは相補しなかった。細胞をMitと細胞質画分に分画し、各画分のNADK活性を測定することにより、シグナル配列のはたらきによりYfjBがMitへと輸送されたことを実証した。これらの結果は、Mitの機能にNADHリン酸化活性が必須でないことを意味した。以上の結果は、細胞の、特にMitの機能にNADHキナーゼ活性が重要であるとする従来の知見に修正をせまる成果となった。

NADP（H）和NAD（H）参与了大量的生物反应，并且具有完全不同的功能，因此NADP（H）/NAD（H）比率的波动是用于活体代谢和细胞活性预计会产生巨大影响。控制键的关键之一是NAD激酶（NADK）。但是，NADK转换为NADP（H）/NAD（H）比率控制机制有许多未知点。大多数生物的纳德克（不包括大肠杆菌）表明NAD和NADH的活性。这意味着NADK可以通过通过NAD磷酸化或NADH磷酸化活性合成NADP合成来促进NADP（H）/NAD（H）比控制机。但是，尚不清楚哪种活动在生理上很重要。这项研究表明，线粒体（MIT）型NADK（MIT）NADK（MIT）NADK（POS5P）的NADH激酶活性是天然生物的模型生物，这对于细胞生长和MIT功能并不是必不可少的。换句话说，将NADK（YFJB：NADH的磷氧化活性）连接到POS5启动子的下游和信号序列（将传输到MIT所需的）中，这是Yeeflutrlpos5，这是Yeeflutrlpos5，将其固结为Yeeflutrlpos5，将其巩固。三重缺陷共享（但是，由于YCP-UTR1函数而不是致命的）。当YCP-UTR1被质粒jiffing遗漏时，酵母显示出生长。这意味着NADH激酶活性对于酵母的生长不是必不可少的。此外，当评估与MIT函数相关的表达式类型时，具有信号序列的YFJB补充了ARG要求和氧化应力敏感性，但不补充具有相同数组的YFJB。通过将细胞分为MIT和植物，并测量每幅画的NADK活性，它表明YFJB由于信号序列的功能而被运输到MIT。这些结果意味着NADH磷酸化活性对于MIT功能不是必不可少的。上述结果已修改为常规知识，即NADH激酶活性很重要，特别是对于MIT的功能。