細胞外環境に応答したNADP(H)/NAD(H)比制御の分子機構と生理的意義

细胞外环境响应NADP(H)/NAD(H)比例调节的分子机制及生理意义

基本信息

批准号：
19780057
负责人：
河井重幸
金额：
$ 2.35万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

NADP(H)とNAD(H)は膨大な生体内反応に関わり、且つ両補酵素の機能が全く異なるため、NADP(H)/NAD(H)比の変動は生体内代謝系および細胞活動に甚大な影響を及ぼすと予想される。同比制御の鍵となる酵素の一つがNADキナーゼ(NADK)である。しかし、生体内NADP(H)/NAD(H)比制御機構へのNADKの寄与に関しては、不明点が多く残されている。ほとんどの生物(大腸菌を除く)のNADKは、NADとNADHの両方をリン酸化する活性を示す。これは、NADKは、NADのリン酸化活性によるNADP合成またはNADHのリン酸化活性によるNADPHの合成を通じて、NADP(H)/NAD(H)比制御機に寄与し得ることを意味する。しかし、どちらの活性が生理的に重要であるかは不明であった。本研究により、真核生物のモデル生物である出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのミトコンドリア(Mit)型NADK(Pos5p)のNADHキナーゼ活性が、細胞の生育ならびにMitの機能に必須ではないことを明らかにした。すなわち、POS5のプロモーターの下流およびシグナル配列(Mitへの輸送に必要)の下流に、大腸菌由来NADK(YfjB:NADHのリン酸化活性を示さない)を連結したキメラプラスミドを構築し、これを酵母NADK三重欠損株yeflutrlpos5(ただしYCp-UTR1のはたらきにより致死とならない)に導入した。プラスミド・ジャフリングによりYCp-UTR1を欠落させたところ、酵母は生育性を示した。これは、酵母の生育性にNADHキナーゼ活性が必須ではないことを意味した。さらに、Mitの機能に関わる表現型も評価したところ、シグナル配列を有するYfjBがArg要求性と酸化ストレス感受性を相補したが、同配列を持たないYfjBは相補しなかった。細胞をMitと細胞質画分に分画し、各画分のNADK活性を測定することにより、シグナル配列のはたらきによりYfjBがMitへと輸送されたことを実証した。これらの結果は、Mitの機能にNADHリン酸化活性が必須でないことを意味した。以上の結果は、細胞の、特にMitの機能にNADHキナーゼ活性が重要であるとする従来の知見に修正をせまる成果となった。

因为NADP（H）和NAD（H）参与了广泛的体内反应，并且两种辅酶的功能都是完全不同的，因此预计NADP（H）/NAD（H）/NAD（H）比率的变化将对体内代谢系统和细胞活性产生显着影响。相等比率控制的关键酶之一是NAD激酶（NADKS）。但是，关于NADK对控制NADP（H）/NAD（H）比率的机制的贡献，有许多未知数。大多数生物（大肠杆菌除外）的NADK都表现出磷酸化NAD和NADH的活性。这意味着NADK可以通过NAD的NAD磷酸化活性或NADH合成NADPH的磷酸化活性来促进NADP（H）/NAD（H）比率调节剂。但是，目前尚不清楚哪种活动在生理上很重要。这项研究表明，真核生物的模型生物体，线粒体（MIT） - 型NADK（POS5P）的NADH激酶活性对于MIT的细胞生长和功能并不是必不可少的。 In other words, a chimeric plasmid was constructed in which E. coli-derived NADK (which does not exhibit phosphorylation activity of YfjB:NADH) was linked downstream of the promoter of POS5 and downstream of the signal sequence (required for transport to Mit), and this was introduced into the yeast NADK triple-deficient strain yeflutrlpos5 (but not lethal due to the function of ycp-utr1）。通过质粒Jafring去除YCP-UTR1，酵母显示生存能力。这意味着NADH激酶活性对于酵母生长并不是必不可少的。此外，在评估MIT的功能时，具有信号序列的YFJB补充了ARG要求和氧化应激敏感性，而没有相同序列的YFJB并未补充。将细胞分馏为MIT和细胞质级分，并通过测量每个馏分的NADK活性，证明由于信号序列的功能，将YFJB转运到MIT。这些结果表明，NADH磷酸化活性对于MIT功能并不是必需的。以上结果提供了先前发现的详细修订，即NADH激酶活性对于细胞（尤其是MIT）的功能很重要。