N,N'-ジアセチルキトビオース受容体タンパク質の基質認識機構の解明

N,N-二乙酰壳二糖受体蛋白底物识别机制的阐明

基本信息

批准号：
02J20027
负责人：
齋藤明広
金额：
$ 0.7万
依托单位：
National Institute of Agrobiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1)NgcEタンパク質の結晶構造解析.平成14年度に大量発現系と精製系を確立したNgcEタンパク質(N-アセチルグルコサミンおよびN,N'-ジアセチルキトビオース結合タンパク質)について,結晶化条件の検討を行った.その結果,条件の1次,二次スクリーニングを経て,2.1Aの解像度でX線の反射をする質の良い結晶を得ることができた.また,大腸菌メチオニン要求性変異株を用いて,メチオニン残基をセレノメチオニンで置き換えたNgcEタンパク質を過剰発現し,精製した.セレノメチオニンでラベルされたNgcEタンパク質の結晶が類似条件下で得られ,2.0Aの解像度の反射を得た.2)キトビオース結合タンパク質活性測定系の確立.ABC輸送系の受容体タンパク質の基質特異性を調べるための簡便法として,ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)に基づいた方法の確立を行った.基質は,N,N'-ジアセチルキトビオース{(GlcNAc)_2}あるいはN,N',N''-テトラアセチルキトトリオース{(GlcNAc)_3}の還元末端をAPEA(aminophenylethylamine)のエチルアミノ基と反応させ、その後,得られたAPEA誘導体のアミノフェニル基とBSA(牛血清アルブミン)中のアミノ基とをグルタルアルデヒドをリンカーとしてカップリングすることによって合成した.BSAへのGlcNAc残基の導入の確認は,WGA(wheat germ agglutinin:GlcNAc残基を特異的に認識するレクチン)を用いて行った.本方法の有効性を,既に基質特異性がプラズマ共鳴装置を用いて決定されているNgcEタンパク質を用いて検討したところ,これらの基質を用いた測定方法が,基質特異性の決定に有効であることが確認された.

1）NgcE蛋白的晶体结构分析。2002年，我们建立了NgcE蛋白（N-乙酰氨基葡萄糖和N,N'-二乙酰壳二糖结合蛋白）的大规模表达和纯化系统。因此，我们研究了结晶条件，结果，经过第一次和第二次筛选，我们获得了蛋氨酸营养缺陷型突变的高质量晶体。利用菌株过表达并纯化蛋氨酸残基被硒代蛋氨酸取代的NgcE蛋白，在相似条件下获得硒代蛋氨酸标记的NgcE蛋白晶体，并获得分辨率为2.0 A的反射。2)壳二糖结合蛋白活性测定体系的建立。 ELISA（酶联法）免疫吸附剂底物为N,N'-二乙酰壳二糖{(GlcNAc)_2}或N,N',N''-四乙酰壳三糖{(GlcNAc)_3}的还原端APEA（氨基苯乙胺）然后使用戊二醛作为接头将获得的 APEA 衍生物的氨基苯基与 BSA（牛血清白蛋白）中的氨基偶联。为了确认该基团的引入，使用 WGA（小麦）。使用已使用等离子共振装置测定其底物特异性的NgcE蛋白来研究该方法的有效性，确认使用这些底物的测量方法对于测定底物特异性是有效的。