ベスタチンの歯周病関連細菌に対する増殖抑制作用の機序についての研究

贝他汀抑制牙周病相关细菌生长的机制研究

• 批准号: 16791324
• 负责人: 林 潤一郎
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Aichi Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16791324/
• 关键词: 成人性歯周炎; Porphyromonas gingivalis; トランスポゾン; ベスタチン

成人性歯周炎は、Porphyromonas gingivalis(以下P.gingivalis)の関与が強く示唆されており、近年、本菌の増殖を選択的に抑制する物質として、アミノペプチダーゼBの阻害剤であるベスタチンの効果が報告されているが、その作用機序は不明である。本研究の目的は、トランスポゾンによるランダム変異導入法を用いてベスタチン耐性変異株を分離し、トランスポゾンをマーカーとして変異したDNA領域をクローニング、その塩基配列を決定し、その結果をもとにベスタチン作用部位の遺伝子について検討を加えることである。トランスポゾンを持つ大腸菌とP.gingivalis33277株とを混合・接合させトランスポゾンをP.gingivalisへ導入、エリスロマイシン耐性の変異株(トランスコンジュガント)を選択分離した。約20回の接合実験を行い合計約25000株のトランスコンジュガントを得た。得られたトランスコンジュガントを最小発育阻止濃度(MIC)の4〜8倍量のベスタチンを添加した培地で培養し、ベスタチン耐性株の分離を試みた。その結果、1株のベスタチン耐性株(TnB1)が分離された。変異株TnB1のMICは親株の5〜10倍であった。プロテアーゼ活性は若干の低下を示したが有意差は見られなかった。サザンブロット法を用いてトランスポゾンの挿入形式を解析した結果、単一のトランスポジションやコインテグレーションといった典型的な挿入形態はとっていなかった。トランスポゾンの挿入されている部位のDNA断片を大腸菌に一部クローニングした。クローニングした断片について、約3kbの塩基配列を決定し、相同性の検索を行ったところ、相同性の高い配列は見つからなかった。塩基配列の決定されているP.gingivalisW83株とは一致する配列が一部に見られたが、一致しない部分も多く、変異が挿入された部分の機能について塩基配列から検討することはできなかった。現在、親株の同部位に薬剤耐性カセットによる変異を生じさせ、ベスタチン耐性が得られるか検討を行っている。また、トランスポゾンの挿入形式が複雑であるため、他の部位にも変異が生じている可能性について調べている。

人们强烈认为牙龈卟啉单胞菌（以下简称牙龈卟啉单胞菌）与成人牙周炎有关，近年来，作为选择性抑制牙龈卟啉单胞菌生长的物质，氨基肽酶B抑制剂贝斯汀（bestatin）的作用得到了研究。这种细菌已有报道，但其作用机制尚不清楚。本研究的目的是利用基于转座子的随机诱变方法分离出贝他汀抗性突变株，以转座子为标记克隆突变DNA区域，确定其碱基序列，并利用结果确定贝他汀作用位点目的是考虑基因。将携带转座子的大肠杆菌与牙龈卟啉单胞菌菌株33277混合并缀合，将转座子引入牙龈卟啉单胞菌，选择并分离红霉素抗性突变株（转接合体）。进行了约20次接合实验，总共获得了约25,000个转接合子。将获得的转接合子在添加了最低抑制浓度(MIC)4至8倍的贝他汀的培养基中培养，并尝试分离贝他汀抗性菌株。结果，分离出一株贝他汀抗性菌株（TnB1）。突变株TnB1的MIC是亲本株的5～10倍。蛋白酶活性略有下降，但没有观察到显着差异。使用Southern印迹分析转座子的插入格式表明，它没有采用典型的插入格式，例如单一转座或共整合。将含有转座子插入位点的 DNA 片段的一部分克隆到大肠杆菌中。当确定克隆片段的大约3kb核苷酸序列并进行同源性搜索时，没有发现高度同源的序列。虽然有一些序列与牙龈卟啉单胞菌W83菌株相匹配，其核苷酸序列已确定，但有许多部分不匹配，并且无法从核苷酸序列中检查插入突变的功能。我们目前正在研究是否可以通过使用耐药盒在亲本菌株的同一位点创建突变来获得贝他汀耐药性。此外，由于转座子插入格式很复杂，我们正在调查其他位点也发生突变的可能性。