ブタ核移植法の開発および遺伝子改変ブタ作出への応用

猪核移植方法的开发及其在转基因猪生产中的应用

基本信息

批准号：
02J10553
负责人：
川原学
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではブタ核移植法の確立が極めて重要なポイントとなる。申請書では平成14年度の研究計画において、(1)活性化刺激と(2)卵子の体外成熟培養時間が核移植した胚の発生に及ぼす影響を調べる予定であった。この研究計画に則り、以下の知見を得た。活性化刺激法として、卵内カルシウムイオンの一過性の上昇を引き起こすイオノマイシン、電気刺激(150V/mm,60μsec)、また、サイクリンBレベルの低下を誘起しMPF活性を抑制するシクロヘキシミドをそれぞれ単独で適用した場合と、カルシウムイオン系、サイクリンB抑制系各々でより活性可能が高いものを組み合わせた複合活性化法について検討した。実験の結果、活性化刺激を与えた単為発生卵の胚盤胞期への発生率が最も高かったのはイオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドこれら3者の複合刺激を施した処理区であった。さらに、顕微注入によって核移植した胚に対しても同様に3者の複合処理を施した場合、単独で活性化した場合よりも有意に高い発生率を示した。以上から、イオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドの3者複合活性化刺激は核移植した胚の発生率を向上させることが示された。レシピエント卵子の体外成熟培養時間が核移植胚の発生に及ぼす影響を調べた。体外成熟培養36、40、44時間での卵子の成熟率には差がなかった。しかし、36時間体外成熟培養を施した成熟卵子は核移植胚の胚盤胞期までの発生を支持することができなかった。また、40と44時間の体外成熟培養時間では40時間の方が核移植に供した場合有利に高い発生率を引き出すことが明らかになった。また、研究の進行状況から平成15年度の研究計画の内容にも着手した。移植後の核の形態変化を調べ、その形態変化が核移植の発生に及ぼす影響を調べた。その結果、卵子内の成熟促進因子MPFによる核の凝縮が核移植した胚の発生に重要であることが明らかになった。(2)の実験結果とも考慮し、核の初期化にはMPFの高い卵細胞質に核を曝すことが重要であると推察された。以上(1)から(3)の研究成果を踏まえ、平成15年度にはMPF活性と核の初期化との関係を分子レベルで解析し、さらに核移植された胚の個体への発生を確認すべく仮親豚への核移植胚移植を行った。核移植の操作間で、特に核注入操作によってレシピエント卵子内のMPF活性が低下してしまうことをつきとめ、問題解決として操作培地中へのMPF活性維持剤であるカフェインを添加することで活性の低下を防ぐことに成功した。またカフェイン処理によって早期染色体凝縮を起こす核移植胚の割合が高まり、体外での発生率を改善することにも成功した。さらに、リアルタイムPCR法によって未分化特異的遺伝子Oct4の遺伝子発現を解析し、核移植胚のOct4発現が体外受精卵よりも低くなることをつきとめた。しかし、全30回に渡って仮親へ核移植卵を胚移植したが妊娠70日前後で流産してしまい、個体を得ることはできなかった。以上本研究をまとめると、体内での発生能力に課題を残しつつも、体外でのミニブタ体細胞由来核移植卵の発生能力を高めることには成功し、新たな問題を提起するとともに本研究の知見はミニブタクローンの研究領域に貢献するものと考えられる。

在这项研究中，建立猪核转移方法是极其重要的点。该应用旨在研究（1）激活刺激和（2）卵在2002年研究计划中鸡蛋的体外成熟培养时间对核转移胚胎的发展。根据本研究计划，获得了以下发现。作为一种激活刺激方法，我们研究了离子霉素，电刺激（150 v/mm，60μsec）的组合，这会导致鸡蛋中钙离子的短暂增加和环己二酰亚胺的瞬时增加，从而诱导Cyclin B水平的降低，并抑制MPF活性的降低，并抑制了Carcin和Cyclin and Cancin和Cyclin in In In In In In In Inion b in in Inion b in Cycim in Inion b in Inion b in Inion b in Cyclin in Inion b in Inion b。实验结果表明，胚泡阶段的孤雌卵的发生率最高的是在治疗区域中遇到了离子霉素，电刺激和环己酰亚胺的结合。此外，当通过显微注射核转移的胚胎经过三种综合治疗时，发病率显着高于单独激活时。从以上表明，刺激离子霉素，电刺激和环己酰亚胺在三部分激活中的组合可改善核移植的胚胎的发生率。研究了受体卵的体外成熟时间对核移植的胚胎发展的影响。在体外成熟培养物36、40和44小时内，卵成熟率没有差异。但是，经过体外培养的成熟卵无法支持核转移胚胎到胚泡阶段的发展。还揭示了40和44小时40小时的体外成熟时间，在经受核转移时会引起更高的发病率。此外，根据研究的进展，我们还开始制定2003年研究计划的内容。我们研究了植入后细胞核的形态变化，并研究了形态变化对核转移发展的影响。结果表明，卵内成熟因子MPF对核对核的凝结对于发展核转移的胚胎很重要。考虑到（2）中的实验结果，据估计，将细胞核以高MPF暴露于鸡蛋细胞质对于核重编程很重要。基于（1）至（3）的上述研究结果，在2003年，在分子水平上分析了MPF活性与核重编程之间的关系，为了确认个体中核转移的胚胎的发展，将核转移的胚胎转移到临时猪中。我们已经确定，受体卵中的MPF活性在核转移操作过程中降低，尤其是由于核注射操作，作为解决问题的解决方案，我们成功地通过添加咖啡因（一种将MPF活性在操纵培养基中维持的药物）成功地阻止了活性的降低。此外，咖啡因的处理增加了经历早期染色体冷凝的核移植胚胎的比例，并能够在体外提高发病率。此外，通过实时PCR分析了未分化的特异性基因OCT4的基因表达，并确定核转移的胚胎中的OCT4表达低于体外受精卵。但是，共有30个胚胎被转移给临时父母，但该患者在怀孕70天左右遭受流产，无法获得个人。上面的这项研究的摘要，尽管仍然留下了体内发展能力的问题，但它成功地提高了从迷你猪体细胞中从体内开发营养的能力，提出了新问题，并且人们相信这项研究的发现将有助于迷你鸽子克隆的研究领域。