ブタ核移植法の開発および遺伝子改変ブタ作出への応用

猪核移植方法的开发及其在转基因猪生产中的应用

基本信息

批准号：
02J10553
负责人：
川原学
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではブタ核移植法の確立が極めて重要なポイントとなる。申請書では平成14年度の研究計画において、(1)活性化刺激と(2)卵子の体外成熟培養時間が核移植した胚の発生に及ぼす影響を調べる予定であった。この研究計画に則り、以下の知見を得た。活性化刺激法として、卵内カルシウムイオンの一過性の上昇を引き起こすイオノマイシン、電気刺激(150V/mm,60μsec)、また、サイクリンBレベルの低下を誘起しMPF活性を抑制するシクロヘキシミドをそれぞれ単独で適用した場合と、カルシウムイオン系、サイクリンB抑制系各々でより活性可能が高いものを組み合わせた複合活性化法について検討した。実験の結果、活性化刺激を与えた単為発生卵の胚盤胞期への発生率が最も高かったのはイオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドこれら3者の複合刺激を施した処理区であった。さらに、顕微注入によって核移植した胚に対しても同様に3者の複合処理を施した場合、単独で活性化した場合よりも有意に高い発生率を示した。以上から、イオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドの3者複合活性化刺激は核移植した胚の発生率を向上させることが示された。レシピエント卵子の体外成熟培養時間が核移植胚の発生に及ぼす影響を調べた。体外成熟培養36、40、44時間での卵子の成熟率には差がなかった。しかし、36時間体外成熟培養を施した成熟卵子は核移植胚の胚盤胞期までの発生を支持することができなかった。また、40と44時間の体外成熟培養時間では40時間の方が核移植に供した場合有利に高い発生率を引き出すことが明らかになった。また、研究の進行状況から平成15年度の研究計画の内容にも着手した。移植後の核の形態変化を調べ、その形態変化が核移植の発生に及ぼす影響を調べた。その結果、卵子内の成熟促進因子MPFによる核の凝縮が核移植した胚の発生に重要であることが明らかになった。(2)の実験結果とも考慮し、核の初期化にはMPFの高い卵細胞質に核を曝すことが重要であると推察された。以上(1)から(3)の研究成果を踏まえ、平成15年度にはMPF活性と核の初期化との関係を分子レベルで解析し、さらに核移植された胚の個体への発生を確認すべく仮親豚への核移植胚移植を行った。核移植の操作間で、特に核注入操作によってレシピエント卵子内のMPF活性が低下してしまうことをつきとめ、問題解決として操作培地中へのMPF活性維持剤であるカフェインを添加することで活性の低下を防ぐことに成功した。またカフェイン処理によって早期染色体凝縮を起こす核移植胚の割合が高まり、体外での発生率を改善することにも成功した。さらに、リアルタイムPCR法によって未分化特異的遺伝子Oct4の遺伝子発現を解析し、核移植胚のOct4発現が体外受精卵よりも低くなることをつきとめた。しかし、全30回に渡って仮親へ核移植卵を胚移植したが妊娠70日前後で流産してしまい、個体を得ることはできなかった。以上本研究をまとめると、体内での発生能力に課題を残しつつも、体外でのミニブタ体細胞由来核移植卵の発生能力を高めることには成功し、新たな問題を提起するとともに本研究の知見はミニブタクローンの研究領域に貢献するものと考えられる。

猪核移植方法的建立是本研究中极其重要的一点。申请书称，2002年的研究计划是研究(1)激活刺激和(2)卵母细胞体外成熟培养时间对核移植胚胎发育的影响。根据该研究计划，获得了以下发现。作为激活刺激方法，我们分别使用了引起卵内钙离子短暂增加的离子霉素和电刺激（150V/mm，60μsec）以及诱导细胞周期蛋白B水平降低并抑制MPF活性的放线菌酮。联合激活方法，将更容易被激活的钙离子系统和细胞周期蛋白B抑制系统组合起来。实验结果显示，在接受离子霉素、电刺激和放线菌酮联合刺激的组中，单性生殖卵发育至囊胚期的比率最高。此外，当通过显微注射进行核移植的胚胎用三者的组合进行类似处理时，发生率显着高于单独激活时。由此可见，离子霉素、电刺激、放线菌酮三路联合激活刺激提高了核移植胚胎的发生率。我们研究了受体卵母细胞体外成熟培养时间对核移植胚胎发育的影响。体外成熟培养36、40、44小时后卵子成熟率无差异。然而，经过36小时体外成熟培养的成熟卵母细胞无法支持核移植胚胎发育至囊胚期。此外，还揭示了在体外成熟培养时间40和44小时之间，当进行核移植时，40小时产生有利的较高发生率。另外，根据研究的进展，我们已经开始制定2003财年研究计划的内容。我们研究了移植后细胞核的形态变化，并研究了这些形态变化对核移植发生的影响。结果表明，卵母细胞中成熟促进因子MPF的核浓缩对于核移植胚胎的发育很重要。考虑到(2)中的实验结果，推断将细胞核暴露于具有高MPF的卵细胞质对于核重编程很重要。基于上述（1）至（3）的研究结果，2003年度我们在分子水平上分析了MPF活性与核重编程之间的关系，并进一步证实了核移植胚胎发育为个体的情况。将胚胎移植到寄养猪中。在核移植操作过程中，我们发现受体卵母细胞中的MPF活性降低，特别是在核注射操作过程中，为了解决这个问题，我们在操作介质中添加了咖啡因这种维持MPF活性的药剂，以提高MPF活性。成功阻止了活动的下降。咖啡因处理还增加了核移植胚胎进行早期染色体浓缩的比例，并成功提高了体外发育率。此外，我们利用实时PCR分析了未分化特异性基因Oct4的基因表达，发现核移植胚胎中Oct4的表达低于体外受精卵中的表达。然而，虽然总共用核移植卵移植了30个胚胎给养母，但胚胎在妊娠70天左右就流产了，没有能够获得个体。总结这项研究的结果，我们成功地提高了小型猪体细胞来源的核移植卵在体外发育的能力，尽管它们在体内发育的能力仍然存在一些问题。这项研究提出了新的问题并支持开发这项研究的结果预计将为小型猪克隆研究领域做出贡献。