アメリカザリガニの硬組織の石灰化に関与する有機基質に関する研究

参与美洲小龙虾硬组织矿化的有机基质研究

基本信息

批准号：
02J08527
负责人：
井上宏隆
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

1.外骨格基質ペプチドCAP-1の構造活性相関アメリカザリガニの外骨格から単離されたCAP-1はin vitroにおいて、炭酸カルシウム結晶形成阻害活性とカルシウム結合活性を有しており、外骨格の石灰化に重要な役割を果たしていると考えられる。これらのin vitroにおける機能と構造の関連性を明らかとするために、大腸菌を宿主とした、様々な変異体CAP-1の発現系を構築した。得られたこれらのペプチドについて、炭酸カルシウム結晶形成阻害活性とカルシウム結合活性を調べた結果、C末端酸性領域を削除したペプチドはどちらの活性も低下したことから、C末端酸性領域がカルシウムイオンおよび炭酸カルシウム結晶との相互作用に重要であることがわかった。また、これらのペプチドについてCDスペクトルを測定した結果、すべてのペプチドはカルシウム濃度依存的にスペクトルが変化することがわかった。その中でもN末端領域を削除したペプチドは、他のペプチドと比較してスペクトルが大きく異なり、カルシウムによるスペクトル変化の割合も小さいことがわかった。以上の結果から、CAP-1のN末端領域はペプチドの構造の維持とカルシウムによる構造変化に何らかの寄与をしていることがわかった。2.CAP-1の発現制御機構の解明CAP-1は外骨格の石灰化が起こる脱皮後期特異的に発現していることから、エクジステロイドにより誘導される初期もしくは後期遺伝子によって、その発現が制御されていると考えられた。そこで、表皮組織を組織培養した結果、エクジステロイド存在下で一定時間培養した後に、非存在下で培養することによって、その発現が誘導されることがわかった。また、CAP-1の転写制御領域をクローニングし、哺乳類細胞、昆虫細胞を用いてレポーターアッセイを行ったが、転写活性化能に差は認められなかった。

1。从美国小龙虾的外骨骼中分离出的外骨骼底物肽CAP-1的结构活性关系，在体外具有碳酸钙晶体形成抑制活性和钙结合活性，被认为在外骨钙化中起重要作用。为了阐明其功能与体外结构之间的关系，构建了各种突变体CAP-1的表达系统，以及大肠杆菌作为宿主。研究了所获得的肽的碳酸钙晶体形成和钙结合活性的抑制活性，并且由于删除C末端酸性区域的两种肽都降低了其活性，因此发现C末端酸性区域对于与钙离子和钙离子和碳酸钙晶体的相互作用都很重要。此外，测量了这些肽的CD光谱，发现所有肽的光谱都以钙浓度依赖性方式变化。其中，已删除N末端区域的肽具有明显不同的光谱，并且由于钙引起的光谱变化的比例也很小。从上述结果中可以发现，CAP-1的N末端区域有助于维持肽结构以及钙引起的结构变化。 2。阐明CAP-1表达机理，因为CAP-1在摩擦的后期特异性表达，这是在发生外骨骼钙化发生时发生的，因此认为其表达受到ecdy-肌动素引起的早期或晚期基因的调节。因此，由于组织培养的结果，发现表皮组织的表达是通过在ecdysteroid存在的一定时间内培养而诱导的，然后在没有组织的情况下培养。此外，克隆了CAP-1的转录调节区域，并使用哺乳动物和昆虫细胞进行了记者测定，但在转录激活能力中未观察到差异。