アメリカザリガニの硬組織の石灰化に関与する有機基質に関する研究

参与美洲小龙虾硬组织矿化的有机基质研究

基本信息

批准号：
02J08527
负责人：
井上宏隆
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

1.外骨格基質ペプチドCAP-1の構造活性相関アメリカザリガニの外骨格から単離されたCAP-1はin vitroにおいて、炭酸カルシウム結晶形成阻害活性とカルシウム結合活性を有しており、外骨格の石灰化に重要な役割を果たしていると考えられる。これらのin vitroにおける機能と構造の関連性を明らかとするために、大腸菌を宿主とした、様々な変異体CAP-1の発現系を構築した。得られたこれらのペプチドについて、炭酸カルシウム結晶形成阻害活性とカルシウム結合活性を調べた結果、C末端酸性領域を削除したペプチドはどちらの活性も低下したことから、C末端酸性領域がカルシウムイオンおよび炭酸カルシウム結晶との相互作用に重要であることがわかった。また、これらのペプチドについてCDスペクトルを測定した結果、すべてのペプチドはカルシウム濃度依存的にスペクトルが変化することがわかった。その中でもN末端領域を削除したペプチドは、他のペプチドと比較してスペクトルが大きく異なり、カルシウムによるスペクトル変化の割合も小さいことがわかった。以上の結果から、CAP-1のN末端領域はペプチドの構造の維持とカルシウムによる構造変化に何らかの寄与をしていることがわかった。2.CAP-1の発現制御機構の解明CAP-1は外骨格の石灰化が起こる脱皮後期特異的に発現していることから、エクジステロイドにより誘導される初期もしくは後期遺伝子によって、その発現が制御されていると考えられた。そこで、表皮組織を組織培養した結果、エクジステロイド存在下で一定時間培養した後に、非存在下で培養することによって、その発現が誘導されることがわかった。また、CAP-1の転写制御領域をクローニングし、哺乳類細胞、昆虫細胞を用いてレポーターアッセイを行ったが、転写活性化能に差は認められなかった。

1.外骨骼底物肽CAP-1的构效关系从美洲小龙虾的外骨骼中分离出的CAP-1在体外具有碳酸钙晶体形成抑制活性和钙结合活性，并被认为在钙化中发挥重要作用。为了阐明这些体外功能和结构之间的关系，我们以大肠杆菌为宿主构建了各种突变体CAP-1的表达系统。对这些获得的肽的碳酸钙晶体形成抑制活性和钙结合活性进行检查，结果发现，C末端酸性区域缺失的肽降低了这两种活性，这对于与钙的相互作用是重要的。晶体。此外，测量这些肽的CD光谱的结果发现，所有肽的光谱都以钙浓度依赖性方式变化。其中，N端区域被删除的肽与其他肽相比，其光谱有显着差异，并且由于钙引起的光谱变化的比例也很小。上述结果表明CAP-1的N端区域对肽结构的维持和钙诱导的结构变化有一定的贡献。 2.CAP-1表达控制机制的阐明由于CAP-1在外骨骼发生钙化的蜕皮晚期特异性表达，因此其表达可能受到蜕皮类固醇诱导的早期或晚期基因的控制。控制。对表皮组织进行组织培养的结果发现，通过在存在蜕皮类固醇的情况下培养一定时间，然后在不存在蜕皮类固醇的情况下进行培养，可以诱导蜕皮类固醇的表达。此外，我们克隆了CAP-1的转录控制区，并使用哺乳动物和昆虫细胞进行了报告基因检测，但没有观察到转录激活能力的差异。