遺伝子発現制御における転写因子GATA1ネットワークの解明

阐明转录因子 GATA1 网络在基因表达调控中的作用

基本信息

批准号：
02J06260
负责人：
西川恵三
金额：
$ 1.92万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J06260/
关键词：
ゼブラフィッシュ GATA1 二量体 pbr 造血 Nrf2 p300 GATA配列 Self-association アセチル化トランスジェック GFP 変異体

项目摘要

本年度の研究によって、以下の諸点を明らかにした。1.ノックダウン法を用いたpbrの機能解析:ゼブラフィッシュ初期胚へアンチセンスモルフォリノオリゴを注入し、pbrのノックダウン胚(pbrモルファント)の表現型を解析した結果、低色素性の血球産生による貧血が観察された。pbrモルファントにおいて、ヘモグロビン合成に関わる遺伝子群b-globin、alas-e、aladの発現をin situ hybridization法を用いて解析した結果、野生型との間に有意な差は観察されなかった。2.GATA1の新規標的遺伝子pbrの発現部位の同定:ゼブラフィッシュのgata1変異胚と野生胚を用いたサブトラクション法によりGATA1の標的遺伝子を探索した結果、pbrを単離した。同定されたGATA1の新規標的遺伝子pbrの発現をin situ hybridization法を用いて解析した。盤割期、胞胚期では、細胞全体に発現していた。原腸胚期、尾芽期では低下し、体節期では造血部位および前腎管で発現が観察された。この造血部位での発現は、gata1変異胚で大きく低下したが、前腎管での発現に変化は見られないことが明らかとなった。3.GATA1と相互作用する因子の単離:GATA1と協調的に機能する転写因子を明らかにするために、生化学的手法を用いた相互作用因子の精製・同定を行った。予備的実験として、転写因子Nrf2にFLAG及びHis標識を行った組み換えタンパクを作製し、HeLa細胞の核抽出液を用いて、Nrf2の相互作用因子の精製を行った。その結果、約80kDa及び400kDaの相互作用因子の精製・同定に成功した。

今年的研究澄清了以下几点。 1.使用敲低方法对pbr进行功能分析：我们将反义吗啉寡核苷酸注射到早期斑马鱼胚胎中，并分析了pbr敲低胚胎（pbr morphants）的表型，结果发现它们产生了低色素性贫血。在pbr突变体中，利用原位杂交分析了参与血红蛋白合成的基因b-珠蛋白、alas-e和alad的表达，并且在它们与野生型之间没有观察到显着差异。 2.GATA1新靶基因pbr表达位点的鉴定：利用斑马鱼gata1突变体胚胎和野生胚胎，通过差减法寻找GATA1的靶基因，结果分离到了pbr。采用原位杂交方法分析了GATA1新靶基因pbr的表达情况。在卵裂期和囊胚期，它在整个细胞中表达。原肠胚期和尾芽期表达减少，体节期造血部位和前肾管表达。结果表明，在gata1突变胚胎中，该造血位点的表达大大减少，但在前肾管中的表达没有观察到变化。 3.与GATA1相互作用的因子的分离：为了阐明与GATA1协同作用的转录因子，我们采用生化方法对相互作用的因子进行纯化和鉴定。作为初步实验，我们制备了转录因子 Nrf2 带有 FLAG 和 His 标签的重组蛋白，并使用 HeLa 细胞核提取物纯化了 Nrf2 相互作用因子。结果，我们成功纯化并鉴定了大约80kDa和400kDa的相互作用因子。