海洋細菌における環境由来DNAの利用機構の解明

阐明海洋细菌中环境来源DNA的利用机制

基本信息

批准号：
02J00681
负责人：
野中里佐
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J00681/
关键词：
テトラサイクリン薬剤耐性遺伝子伝達海洋細菌 16S rRNA リボソーム保護

项目摘要

平成14年度は香川県の健康養殖ブリ由来腸内細菌、香川県及び韓国の養殖場由来の病魚より分離された細菌、および海水由来細菌に臨床及び畜産の現場および土壌由来の多くのグラム陽性・陰性細菌から検出されるtet(M)遺伝子が分布していることを明らかにした。平成15年度(4月1日から7月31日)は、これらのtet(M)を保有する、養殖ブリ腸内由来菌14株、海水由来菌3株について、PCRを用いてトランスポゾンTn916の検出を行い、ブリ腸内由来菌10株、海水由来株2株がTn916を保有していることが明らかにした。さらにサザンハイブリダイゼーションを行い、これらは細菌のクロモソーム上にコードされていることを明らかにした。Tn916は通常tet(M)と関連して見出され、細菌から細菌へtet(M)を伝達するconjugative transposonとして知られており、海洋環境中でもTn916がtet(M)の伝播、分布に重要な役割を果たしていることが示唆された。また平行して平成14年にひきつづき平成15年7月までカナダ、アルバータ大学医学部,分子微生物・免疫学教室(Department of Molecular Microbiology and Immunology)で研究活動を行った。テトラサイクリン耐性を示す細菌では、16S rRNA上に変異をもつものが報告されている。この変異はテトラサイクリン結合部位付近にみられることから、我々はテトラサイクリンとその作用部位の親和性の変化が耐性に関与しているという仮説をたてた。本実験ではクロモソーム上にコードされた7つのrrn遺伝子(16S rRNA遺伝子)を人為的に欠損させ、プラスミド上にのみrrn遺伝子を持つよう設計された大腸菌を用い、テトラサイクリン耐性と関係があると予測される16S rRNA遺伝子上の変異を人為的に導入し、導入された変異がテトラサイクリン耐性に与える影響を評価した。すなわち、得られた変異株のテトラサイクリンに対する最小発育阻止濃度(MIC)の測定を行うとともに、これらの変異体からのリボソームの抽出を行い、テトラサイクリンに対する親和性を測定した。その結果、テトラサイクリンに対する耐性が高い株ほど、そのリボソームはテトラサイクリンに対して低い耐性を示したことから、テトラサイクリンの作用部位の変異は細菌の耐性化に関与していることが明らかとなった。

2002年，在海水中发现了来自香川县健康养殖的鰤鱼的肠道细菌、从香川县和韩国养殖场的病鱼中分离出的细菌，以及来自临床和畜牧生产场所和土壤的许多革兰氏阳性细菌。结果表明，阴性菌中检测到的tet(M)基因是分布的。 2003年度（4月1日～7月31日），通过PCR在14株培养的鰤鱼肠道来源细菌和3株含有这些tet（M）的海水来源菌株中检测到转座子Tn916，结果发现10株鰤鱼。肠道来源的细菌和 2 株海水来源的菌株含有 Tn916。进一步的Southern杂交表明这些基因是在细菌染色体上编码的。 Tn916 通常与 tet(M) 相关，被称为将 tet(M) 从细菌转移到细菌的接合转座子，即使在海洋环境中，Tn916 对于 tet(M) 的繁殖和分布也很重要。有人认为它发挥了作用。与此同时，2002年至2003年7月，我在加拿大阿尔伯塔大学医学院分子微生物学和免疫学系进行研究。据报道，表现出四环素耐药性的细菌在 16S rRNA 中存在突变。由于这种突变是在四环素结合位点附近发现的，因此我们假设耐药性与四环素对其作用位点的亲和力的变化有关。在这个实验中，染色体上编码的7个rrn基因（16S rRNA基因）被人为删除，大肠杆菌被改造为仅在质粒上携带rrn基因，预计这与四环素耐药性有关，我们在16S上人为地引入了突变。 rRNA 基因并评估引入的突变对四环素耐药性的影响。即，我们测量了获得的突变体对四环素的最低抑制浓度（MIC），从这些突变体中提取核糖体，并测量了它们对四环素的亲和力。因此，对四环素的耐药性越高，核糖体对四环素的耐药性越低，表明四环素作用位点的突变与细菌耐药性有关。