フグ毒(TTX)保有生物におけるTTXの組織内微細分布-酵素免疫学的アプローチ

TTX 在河豚毒素 (TTX) 携带生物体中的组织微分布 - 酶免疫学方法

• 批准号: 02F00518
• 负责人: 荒川 修
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00518/
• 关键词: テトロドトキシン; ヒモムシCephalothrix sp.; ツノヒラムシ; 吻(proboscis); immunogold; 電子顕微鏡; ミドリフグ; リソゾーム; フグ毒; テトロドトキシン(TTX); 免疫組織染色; 組織内微細分布; 光学顕微鏡; モノクローナル抗TTX抗体; 抗マウスIgG immunogold

まず、フグ毒テトロドトキシン(TTX)を保有することが知られている紐形動物(ヒモムシ)と扇形動物(ヒラムシ)を対象として、既報の方店に基づきTTXの組織内微細分布を調べた。すなわち、2003年に広島湾で採取したヒモムシCephalothrix sp.ならびに神奈川県三浦半島で採取したツノヒラムシPlanocera reticulataにつき、10%ホルマリンで固定後、パラフィン包埋し、薄切切片を作成した。いずれも10%H_2O_2および25%ヤギ血清で処理後、抗TTX抗体を反応させ、次いでEnvision+により酵素標識のうえ、DAB基質溶液を用いて発色させた。さらにGill hematoxylinによる対比染色を施した後、光学顕微鏡で観察したところ、Cephalothrix sp.については、まず体壁をみると、TTXの陽性反応(褐色)は、表皮杵状細胞の尖端に配列する小胞と基底膜に認められた。次いで吻(proboscis)では、擬刺胞(pseudocnides)自体にTTXの分布はみられなかったものの、それに隣接する上皮顆粒細胞に顕著な陽性反応が観察された。その他、吻腔(rhynchocoel)上皮、吻腔や血管に近い消化管壁の基底部に分布する小胞、血管中に突き出た腎管の球状末端、卵などにもTTXの分布が確認された。一方、ツノヒラムシでは、卵にのみ顕著なTTX陽性反応が観察された。他方、昨年度の予備実験では、(1)パラホルムアルデヒト等を含むリン酸緩衝液で固定、(2)LR白色樹脂に包埋、(3)超薄切切片作成、(4)抗TTX抗体、次いて抗マウスIgG immunogoldと反応、(5)酢酸ウラニルで染色、(5)電子顕微鏡下での観察、という手順により、フグ組織におけるTTXの超微細分布の可視化が可能であることが示された。この方法をミドリフグTetraodon nigroviridisに適用したところ、TTXは皮の未分化基底細胞と分泌細胞に見られるが、さらに微視的には基底細胞中のリソゾームに局在すること、などか明らかとなった。

首先，我们根据先前报道的鳞翅目和扇尾鱼的方法，研究了 TTX 在组织中的微观分布，已知鳞翅目和扇尾鱼含有河豚毒河豚毒素 (TTX)。即，将2003年从广岛湾采集的石甲虫Cephalothrix sp.和从神奈川县三浦半岛采集的角扁虫Planocera reticulata用10%福尔马林固定，包埋在石蜡中，制备薄片。两者均用 10% H_2O_2 和 25% 山羊血清处理后，与抗 TTX 抗体反应，然后用 Envision+ 进行酶标记，并使用 DAB 底物溶液显色。此外，用吉尔苏木精复染后，用光学显微镜观察发现，对于头丝菌属来说，初看体壁时，TTX（棕色）的阳性反应是由排列在表皮杆状细胞尖端的小细胞引起的。存在于囊肿和基底膜中。接下来，在长鼻（proboscis）中，虽然在假刺线虫本身中没有观察到TTX的分布，但在与其相邻的上皮颗粒细胞中观察到显着的阳性反应。此外，在鼻腔上皮、靠近胃窦腔和血管的胃肠壁基部分布的囊泡、伸入血管的肾管球端和卵中也证实了TTX的分布。另一方面，仅在角扁虫的卵中观察到显着的TTX阳性反应。另一方面，在去年的初步实验中，我们进行了（1）用含有多聚甲醛的磷酸盐缓冲液固定，（2）包埋在LR白色树脂中，（3）超薄切片的制备，（4）抗TTX抗体，以及结果表明，通过以下步骤可以可视化河豚鱼组织中 TTX 的超细分布：（5）与抗小鼠 IgG 免疫金反应，（5）用醋酸双氧铀染色，以及（5）在电子下观察显微镜。当将该方法应用于绿色河豚鱼Tetraodon nigroviridis时，发现TTX存在于未分化的基底细胞和皮肤的分泌细胞中，但在显微镜下它位于基底细胞的溶酶体中。

项目成果

Yahia Mahmud: "Intracellular visualization of tetrodotoxin (TTX) in the skin of a puffer Tetraodon nigroviridis by immunoenzymatic technique"Toxicon. 41・5. 605-611 (2003)

Yahia Mahmud：“通过免疫酶技术观察河鲀皮肤中的河豚毒素 (TTX)”Toxicon 41・5 (2003)。